胃癌細(xì)胞對腹膜間皮細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、胃癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一,腹膜轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者術(shù)后死亡的重要因?yàn)?。正常的腹膜是由單層間皮細(xì)胞及其下方的細(xì)胞外基質(zhì)組成,能夠防止腫瘤細(xì)胞對于腹膜的粘附。對于癌細(xì)胞是如何突破完整連續(xù)的間皮細(xì)胞進(jìn)而進(jìn)行腹膜種植的,目前認(rèn)為早在癌細(xì)胞黏附于腹膜之前,腹膜就已經(jīng)發(fā)生了改變。其中腹膜纖維化是重要的表現(xiàn)形式之一。在本文中我們研究了間皮細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的抵御作用,模擬了游離癌細(xì)胞在接觸腹膜前通過其分泌物導(dǎo)致的腹膜增厚、纖維化的過程,同時觀

2、察了間皮細(xì)胞對胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的反作用。方法:用熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)時間皮細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的抵御作用；向小鼠腹腔分次注入胃癌分泌上清,4周后HE染色、Masson染色、電鏡觀察腹膜變化；電鏡、光鏡下觀察體外實(shí)驗(yàn)中間皮層在胃癌.腹膜相互作用中的損傷和細(xì)胞骨架變化；采用Millicell小室共培養(yǎng)觀察間皮細(xì)胞對胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的反作用。結(jié)果:完整的間皮層能夠防止腫瘤細(xì)胞對于腹膜的粘附。但在間皮細(xì)胞損傷脫落以后,胃癌細(xì)胞輕易粘附在間

3、皮脫落所形成的裸區(qū)。動物實(shí)驗(yàn)顯示:接觸胃癌細(xì)胞上清后腹膜間皮細(xì)胞變?yōu)閳A形、柱形,間皮細(xì)胞脫落,有大量纖維素樣物質(zhì)沉積。在體外實(shí)驗(yàn)中間皮細(xì)胞微絨毛倒伏、斷裂、脫失,細(xì)胞呈梭形改變,細(xì)胞骨架重構(gòu),與體內(nèi)情況一致；間皮細(xì)胞在胃癌轉(zhuǎn)移過程中并不僅僅是“受害者”,還可以是“主動參與者”。胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)損傷間皮后,受損殘余的間皮可以反作用于癌細(xì)胞,使其遷移轉(zhuǎn)移力提高。結(jié)論:(1)正常間皮細(xì)胞可以抵御胃癌細(xì)胞的侵襲,保護(hù)腹膜。(2)胃癌細(xì)胞可以通過其分

4、泌物誘導(dǎo)腹膜纖維化。(3)受損傷刺激后的間皮細(xì)胞可以反作用于胃癌細(xì)胞促進(jìn)其遷移及侵襲。
　　 腹膜轉(zhuǎn)移是進(jìn)展期胃癌根治術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)形式,是胃癌患者的主要死亡因?yàn)?。胃癌?xì)胞誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞的損傷改變很可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)。本研究目的:建立胃癌腹膜轉(zhuǎn)移早期間皮細(xì)胞的損傷模型,確定胃癌腹膜轉(zhuǎn)移早期癌細(xì)胞對間皮細(xì)胞的損傷與細(xì)胞凋亡的聯(lián)系,并探討凋亡程度及相關(guān)蛋白表達(dá)。方法:收集處理人胃癌細(xì)胞分泌的上清,與人腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5共

5、培養(yǎng)。觀察間皮細(xì)胞形態(tài)、增殖改變,透射電鏡確認(rèn)細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀和熒光染色判斷凋亡比例。免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)情況。結(jié)果:接觸胃癌上清24h后,間皮細(xì)胞受損脫落,出現(xiàn)大片裸區(qū)。胃癌細(xì)胞的分泌物明顯的抑制了間皮細(xì)胞的生長,而正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1不能對間皮細(xì)胞構(gòu)成損傷。電鏡下胃癌細(xì)胞上清處理后細(xì)胞膨脹變圓,染色質(zhì)高度凝聚,核膜皺縮,但完整。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹。邊緣化濃縮呈境界分明的細(xì)小團(tuán)塊狀沿核膜內(nèi)側(cè)排列,部分細(xì)胞

6、核解體,核仁消失,胞膜下陷,形成由質(zhì)膜包裹內(nèi)含完整的細(xì)胞器、核碎片等細(xì)胞內(nèi)容物的凋亡小體,證實(shí)了細(xì)胞凋亡的存在。胃癌細(xì)胞上清誘導(dǎo)了間皮細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖,并且程度與時間呈正相關(guān)。胃癌細(xì)胞的上清能明顯抑制間皮細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)；并能增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Bcl-2和Bax的失調(diào)最終導(dǎo)致間皮細(xì)胞凋亡。結(jié)論:胃癌細(xì)胞在腹膜轉(zhuǎn)移早期可以通過其分泌物誘導(dǎo)間皮細(xì)胞損傷、凋亡,凋亡機(jī)制與Bcl-2和Bax的失調(diào)有關(guān)。提示保護(hù)間皮細(xì)

7、胞,抗間皮細(xì)胞凋亡在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移治療中可能有一定應(yīng)用價值。
　　 人腹膜表面的間皮層可以抵御癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。我們認(rèn)為:侵透漿膜的胃癌,脫落形成腹腔游離癌細(xì)胞,癌細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì),在癌細(xì)胞粘附到腹膜之前,誘導(dǎo)了間皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而脫落,導(dǎo)致間皮下結(jié)構(gòu)暴露,形成裸區(qū),這種損傷的腹膜為癌細(xì)胞粘附種植提供了“土壤”。我們之前報(bào)道胃癌可以誘導(dǎo)間皮細(xì)胞凋亡,從而破壞間皮層,促進(jìn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。在本文中我們研究了TGF-β1對胃癌-腹膜相互作用

8、的影響。方法:我們采用ELISA檢測了胃癌分泌上清中的相關(guān)細(xì)胞因子的含量,以及在胃癌.腹膜相互作用中smad 2,3和磷酸化smad 2,3的水平。我們把人腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5分別與TGF-β1、胃癌上清+TGF-β1抑制劑SB4131542共培養(yǎng),觀察了間皮的形態(tài)學(xué)變化,通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色檢測凋亡,評估了TGF-β1對胃癌粘附力的影響。結(jié)果:在本研究中我們觀察到,5種胃癌細(xì)胞系均能分泌大量的TGF-β1,TGF-β1的分泌

9、量明顯多于其他細(xì)胞因子。用western進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1及其信號通路TGF-β1/smad 2,3確實(shí)參與了胃癌對間皮的損傷。TGF-β1和胃癌上清均能破壞間皮層,致?lián)p傷脫落,胃癌細(xì)胞和TGF-β1能明顯影響間皮細(xì)胞生長。由于間皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞均能分泌TGF-β1,所以TGF-β1可以通過自分泌和旁分泌兩種途徑損傷間皮。我們還發(fā)現(xiàn)使用TGF-β1抑制劑SB431542抑制環(huán)境中TGF-β1與間皮上的受體結(jié)合能夠在一定程度上保護(hù)腹