結(jié)直腸癌患者外周血中抗survivin抗體與survivin mRNA表達(dá)及臨床意義.pdf

1、目的:結(jié)直腸癌(CRC)是最常見的消化道腫瘤之一,由于早期診斷率低,術(shù)后易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,其仍是一種具有高侵襲性、高病死率的惡性腫瘤。結(jié)直腸癌的早期診斷及復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)是目前亟待解決的問題,尋找方便有效的標(biāo)志物顯得尤為重要。本研究的目的就是探討結(jié)直腸癌患者外周血中抗survivin抗體及survivin mRNA的表達(dá)情況及其臨床意義,為結(jié)直腸癌的診治提供更多的生物學(xué)標(biāo)志物。
　　方法:選擇CRC患者116例,依據(jù)所接受治療手段,分

2、為根治手術(shù)組、姑息手術(shù)組、姑息化療組。對(duì)照組為30例健康體檢者。根治手術(shù)組和姑息手術(shù)組分別于手術(shù)前1天、術(shù)后第4周末清晨空腹采集外周血5ml,其中根治手術(shù)組每3個(gè)月隨訪一次,抽外周血5ml;姑息化療組于化療前及化療2周期后采集外周血5ml;對(duì)照組清晨空腹采集外周血5ml。所采集血液標(biāo)本中,其中2ml使用無抗凝劑的真空管采集,以3000r/min,離心10min,取上清液,凍存于-20℃冰箱,用于檢測(cè)抗survivin抗體;剩余3ml使用

3、含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空管采集,采集后室溫靜置半小時(shí),然后提取總 RNA,用于檢測(cè)survivin mRNA。應(yīng)用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中抗survivin抗體的水平。向預(yù)先包被人存活素抗體的酶標(biāo)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和辣根過氧化物酶標(biāo)記的存活素抗體,經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的組分,然后依次加入底物A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成為最終的黃色。顏色的深淺與樣品中抗survivin抗體的濃度呈正相關(guān)。通過測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品

4、得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算抗survivin抗體濃度。應(yīng)用半定量RT-PCR法測(cè)定外周血中survivin mRNA相對(duì)表達(dá)水平。首先提取外周血中總RNA,檢測(cè)其純度和完整性后,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系包括5×Buffer2μl,RT Enzyme MixΙ0.5μl,Oligo dT Primer(50M)0.5μl,Random6 mers(100M)0.5μl, Total RNA500ng,,RNase Free dH2O補(bǔ)

5、至10μl。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃,15min,85℃,5s。選取β-actin作內(nèi)參基因,應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。 Survivin mRNA上下游引物分別為5′-GTCCCTGGCTCCTCTACTG-3′,5′-GACGCTTCCTATCACTCTATTC-3′,產(chǎn)物大小為174bp;β-actin上下游引物分別為5′-AGAGCCTCGCCTTTGCCGAT-3′,5′-TGCCAGATTTTCTCCAT

6、GTCGT-3′,產(chǎn)物大小為313bp。25μlPCR反應(yīng)體系包含Premix Ex Taq(2×)12.5μl,上游引物0.5μl,下游引物0.5μl,DNA模板2μl,滅菌蒸餾水9.5μl。經(jīng)過預(yù)變性95℃,30s,34個(gè)循環(huán)(變性95℃,5s,退火60℃,30s,延伸72℃,50s),終延伸72℃,2min,其中survivin循環(huán)數(shù)為34,退火溫度60℃,β-actin循環(huán)數(shù)為28,退火溫度62℃。所得產(chǎn)物進(jìn)行2.5％瓊脂糖電泳

7、鑒定,并應(yīng)用培清凝膠成像分析系統(tǒng),分別測(cè)定β-actin和 survivin條帶的光密度值,并計(jì)算survivin的表達(dá)系數(shù),即survivin的光密度值與β-actin的光密度值之比。應(yīng)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果:1. CRC患者與健康者外周血中抗survivin抗體陽性率分別為40.5%和0,survivin mRNA陽性率

8、分別為76.7%和0,均有顯著差異(P=0.000)。
　　2. CRC患者外周血中抗survivin抗體及Survivin mRNA的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤類型、組織學(xué)分型無關(guān),而與分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。抗 survivin抗體表達(dá)水平及 survivin mRNA陽性率隨著腫瘤分期的增高而增高;腫瘤直徑>5cm者二者表達(dá)水平較腫瘤直徑≤5cm者高,差異具有顯著性( P=0.045, P=0.003);有淋

9、巴結(jié)轉(zhuǎn)移者抗survivin抗體水平及survivin mRNA陽性率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著增高(P=0.040,P=0.000)。
　　3.74例CRC患者行根治性手術(shù),術(shù)后血清中抗survivin抗體水平及survivin mRNA表達(dá)較術(shù)前明顯降低(P=0.005,P=0.004);隨訪過程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移共13例,復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者外周血中二者表達(dá)水平均較前顯著升高(P=0.024,P=0.048)。此外,復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者根治術(shù)后

10、二者表達(dá)水平顯著高于無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者(P=0.001, P=0.004)。14例患者行姑息手術(shù),手術(shù)前后抗survivin抗體和survivin mRNA表達(dá)水平無顯著差異(P=0.709,P=0.669)。
　　4.在行姑息性化療的患者中,有效組抗 survivin抗體和 survivin mRNA表達(dá)水平化療后較化療前明顯降低(P=0.043,P=0.032);無效組抗 survivin抗體水平化療前后變化無顯著性( P=0.1

11、35),而survivin mRNA表達(dá)水平化療后較化療前顯著升高(P=0.039);二者水平均低者較高者對(duì)化療更敏感(P=0.001,P=0.006)。
　　結(jié)論:
　　1.抗survivin抗體和survivin mRNA在CRC患者外周血中表達(dá)較高,可能是監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌的發(fā)病指標(biāo)之一。
　　2.抗survivin抗體和survivin mRNA與腫瘤負(fù)荷、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性,或可作為預(yù)后判定的指標(biāo)之一。

12、
　　3.外周血中 Survivin可能是監(jiān)測(cè)腫瘤微轉(zhuǎn)移及判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)之一。在根治術(shù)后檢測(cè)抗survivin抗體和survivin mRNA水平可對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè);在隨訪過程中定期檢測(cè)有抗survivin抗體和survivin mRNA水平,可監(jiān)測(cè)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。
　　4.姑息化療前抗survivin抗體和survivin mRNA表達(dá)水平或可以作為姑息化療敏感性篩查的指標(biāo)之一;姑息化療前后二者水平變化,可