白介素-4、白介素-6和吸煙、氣道慢性炎癥對慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮細(xì)胞的影響.pdf

1、前言:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流受限特征的肺部疾病。COPD的本質(zhì)是吸入有害顆粒和有害氣體引起的異常炎癥反應(yīng)。COPD的炎癥過程中有多種炎性細(xì)胞浸潤及相關(guān)細(xì)胞因子參與，炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起著十分關(guān)鍵的作用。 氣道上皮細(xì)胞作為氣道的第一道防線其防護屏障不是單純的機械機制，還包括化學(xué)和生物機制，通過離子通道活性的改變可以控制氣道上皮細(xì)胞的厚度和黏液分泌，其中Na+的分泌和重吸收尤為重要。阿米洛

2、利敏感的Na+通道(ENaC)已知由α、β、γ三個亞單位組成，調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞的Na+和水重吸收，是氣道上皮細(xì)胞Na+轉(zhuǎn)運和黏液分泌的重要因素。氣道上皮細(xì)胞表面離子通道的電流變化是呼吸系統(tǒng)疾病病理生理過程中的重要環(huán)節(jié)。用全細(xì)胞膜片鉗記錄其對EnaC電流的影響，探討IL-4、IL-6在氣道Na+的分泌和重吸收中的作用。 在氣道炎癥反應(yīng)過程中，除了炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子的作用以外，炎癥導(dǎo)致氣道壁的損傷和修復(fù)過程反復(fù)循環(huán)發(fā)生，氣道壁的結(jié)構(gòu)

3、重塑，膠原含量增加及疤痕形成，導(dǎo)致氣流受限，引發(fā)COPD的發(fā)生發(fā)展。在呼吸道慢性炎癥的氣道破壞過程中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)起著關(guān)鍵的作用，近年來發(fā)現(xiàn)在COPD患者中MMP-1、MMP-2及MMP-9水平升高，MMPs和其抑制因子組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)失衡。本研究檢測COPD患者中MMPs的轉(zhuǎn)錄及活性及IL-4、IL-6對其作用，研究MMPs和其抑制因子TIMPs失衡是如何影響COPD的發(fā)生發(fā)展。 吸煙和細(xì)菌感染是

4、慢性阻塞性肺疾病的兩個重要發(fā)病因素，二者在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中不是相互孤立的，而是相互促進、相互關(guān)聯(lián)的。 第一部分:IL-4、IL-6對慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮細(xì)胞阿米洛利敏感的Na+通道的影響 分題一:慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮細(xì)胞阿米洛利敏感鈉通道m(xù)RNA表達水平的研究 目的:探討氣道上皮細(xì)胞阿米洛利敏感的Na+通道(ENaC)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機制中的作用及IL-4、IL-6對

5、其影響。 方法:18例因肺部腫瘤而行肺葉切除術(shù)的患者肺標(biāo)本體外分離培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞，根據(jù)患者肺功能檢查結(jié)果及有無吸煙分為三組，即COPD組、正常吸煙對照組及正常對照組，每組6例。用IL-4、IL-6處理原代培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)半定量檢測ENaC三個亞單位α、β、γ的mRNA水平。 結(jié)果:(1)正常吸煙對照組及COPD組的吸光度(A)的α亞單位mRNA水平均明顯較正常對照組明顯升高

6、(P＜0.05)，COPD組γ亞單位mRNA水平也明顯升高；(2)經(jīng)過IL-4處理的正常對照組、正常吸煙對照組及COPD組中ENaC的α亞單位mRNA水平均明顯升高、γ亞單位mRNA水平明顯降低(P＜0.05)；(3)經(jīng)過IL-6處理的正常吸煙對照組α亞單位mRNA水平明顯降低，IL-6處理使COPD組ENaC的β、γ亞單位mRNA水平降低。 結(jié)論:在COPD患者中ENaC的α、γ亞單位mRNA水平的升高，提示ENaC在COPD

7、的發(fā)病過程中起著重要作用，非COPD吸煙者中也發(fā)現(xiàn)類似于COPD的ENaCα亞單位mRNA水平升高，提示吸煙在COPD的發(fā)病過程中起著重要的作用。IL-4、IL-6可能通過影響Na+的重吸收而使COPD患者氣道呈現(xiàn)高分泌狀態(tài)。 分題二:IL-4、IL-6對慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮細(xì)胞阿米洛利敏感的Na+通道電流的影響 目的:研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中阿米洛利敏感的Na+通道電流(Ia

8、mil)及IL-4、IL-6對其影響。 方法:體外分離培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞，經(jīng)過終濃度均為10ng/ml的IL-4、IL-6處理，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中Iamil。 結(jié)果(1)正常不吸煙對照組、正常吸煙對照組及COPD組Iamil值無顯著差異。(2)IL-4處理可以下調(diào)正常不吸煙對照組、正常吸煙對照組及COPD組的Iamil，下調(diào)幅度分別為59.7％、54.7％及30.0％。(3)IL-6處理可以下調(diào)

9、正常不吸煙對照組、正常吸煙對照組的Iamil，下調(diào)幅度分別為44.8％及34.9％，但是IL-6處理不能下調(diào)COPD組Iamil值。(4)IL-4、IL-6處理后的Iamil電流形狀未見明顯改變。 結(jié)論:IL-4及IL-6處理可以下調(diào)體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞的Iamil，提示在COPD患者中升高的IL-4及IL-6水平將有助于氣道高分泌狀態(tài)的形成，同時由于COPD5患者中自身IL-4及IL-6的水平升高，導(dǎo)致培養(yǎng)的COPD患者氣道

10、上皮細(xì)胞對IL-4及IL-6處理的反應(yīng)相對較弱。 第二部分慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶表達和活性研究 目的:觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者體外培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9及其抑制因子組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)1的mRNA表達和MMP-9及MMP-2明膠酶活性。 方法:15例受檢者肺標(biāo)本體外分離培養(yǎng)原代氣道上皮細(xì)胞，根據(jù)患者肺功能檢查結(jié)果及有無吸煙分為三組，即CO

11、PD組、正常吸煙對照組及正常不吸煙對照組，每組6例。用RT-PCR法半定量檢測MMP-9及其抑制因子TIMP-1的mRNA水平；用SDSPAGE明膠酶譜法定量測定MMP-9及MMP-2明膠酶活性。 結(jié)果:(1)正常不吸煙者氣道上皮細(xì)胞MMP-9及TIMP-1的mRNA處于一個較低的水平；(2)COPD患者和正常吸煙者氣道上皮細(xì)胞MMP-9及TIMP-1的mRNA水平較正常不吸煙者均明顯升高(p＜0.05)，但COPD患者和正常吸

12、煙者氣道上皮細(xì)胞MMP-9及TIMP-1的mRNA水平差異無顯著性。(3)COPD患者及正常吸煙者MMP-9/TIMP-1的比值明顯低于正常不吸煙者(p＜0.05)；(4)COPD患者及正常吸煙者氣道上皮細(xì)胞MMP-9及MMP-2活性均增強(p＜0.05)，但COPD患者及正常吸煙者氣道上皮細(xì)胞MMP-9及MMP-2活性差異無顯著性。 結(jié)論:COPD患者氣道上皮細(xì)胞MMP-9及TIMP-1轉(zhuǎn)錄和MMP-9及MMP-2明膠酶活性增

13、強，同時造成MMP-9/TIMP-1的失衡，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生，這些影響在COPD發(fā)病機制中起著重要的作用。 第三部分:香煙煙霧提取物對內(nèi)毒素激活氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSF的影響 目的:探討香煙煙霧提取物(CSE)對細(xì)菌脂多糖(LPS)上調(diào)氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSF表達的影響。 方法:原代培養(yǎng)人體氣道上皮細(xì)胞，應(yīng)用CSE及LPS刺激細(xì)胞，根據(jù)刺激方式分空白對照組、LPS刺激組、CSE刺激組及CSE

14、+LPS組，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測各組原代培養(yǎng)人體氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSFmRNA水平，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組原代培養(yǎng)人體氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSF分泌量。 結(jié)果:對照組氣道上皮細(xì)胞分泌低水平的IL-8和GM-CSF以及低水平的IL-8和GM-CSFmRNA表達。 結(jié)論:細(xì)菌LPS可以刺激氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSF表達上調(diào)，有利于中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和募集，最

15、終清除氣道局部細(xì)菌，屬于機體抵抗疾病的一種防衛(wèi)性機制。CSE可以使LPS刺激的氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSF表達延遲，且其表達高峰降低，妨礙機體的防衛(wèi)機制，有利于氣道感染的細(xì)菌定植，氣道炎癥慢性化，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。 總結(jié): 一、本實驗通過對正常不吸煙者、正常吸煙者及COPD患者原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞的研究，得出以下結(jié)論： 1.正常吸煙者及COPD患者ENaCα亞單位mRNA水平較正常對照組明顯升高，且

16、正常吸煙者及COPD患者之間差異沒有顯著性，提示吸煙在COPD的發(fā)病過程中起著重要的作用； 2.COPD患者ENaCα、γ亞單位表達水平升高，可能使Na+的重吸收增加，導(dǎo)致氣道分泌物粘稠、難以咳出，提示ENaC在COPD的發(fā)病過程中起著重要作用； 3.IL-4、IL-6可能通過影響Na+的重吸收而使COPD患者氣道呈現(xiàn)高分泌狀態(tài)； 4.IL-4、IL-6可以下調(diào)體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞的Iamil，提示在COPD患

17、者中升高的IL-4及IL-6水平將有助于氣道高分泌狀態(tài)的形成； 5.COPD患者肺部的慢性炎癥以及吸煙的刺激可以造成MMP-9及TIMP-1轉(zhuǎn)錄和MMP-9及MMP-2明膠酶活性增強，同時造成MMP-9/TIMP-1的失衡，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生，這些影響在COPD發(fā)病機制中起著重要的作用。 二、通過對細(xì)菌LPS和CSE單獨及共同對人體原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞IL-8和GM-CSF分泌及mRNA影響的研究，得出以下結(jié)論：