基于凝集素芯片的腫瘤細胞表面糖譜分析.pdf

1、眾所周知，惡性腫瘤已成為我國居民的首要死因，占死亡原因20％以上。并且每年還在以驚人的速度增長。而腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移之前的起始階段，若能被早期發(fā)現(xiàn)，及早治療，就可以大大提高腫瘤的治愈率，降低患者病死率。而在目前腫瘤的早期診斷中，腫瘤標志物的檢測正日益成為臨床檢測中常用的檢測手段之一。
　　 而作為真核細胞蛋白翻譯后修飾中的一個最主要的形式，幾乎所有涉及細胞識別、粘附、遷移、凋亡等細胞生理活動以及分化、發(fā)育、免疫應(yīng)答等重要生命活動的

2、膜蛋白和分泌蛋白表達后均伴有糖基化的發(fā)生。并且科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細胞的表面糖基化相對于正常細胞都發(fā)生了明顯的改變，而細胞表面糖基化的差異在一定程度上反映了細胞內(nèi)在的生理狀態(tài)。因此，腫瘤細胞表面糖基化的變化可以成為預(yù)測腫瘤細胞的類型，惡化程度及轉(zhuǎn)移傾向的線索。在本文中我們嘗試利用凝集素芯片這個高通量，譜系化的研究手段對腫瘤細胞的表面糖結(jié)構(gòu)進行篩查,期待找到一些能與腫瘤細胞分類以及轉(zhuǎn)移，惡化相關(guān)聯(lián)的糖標志物。
　　 本文分為四部分

3、，主要圍繞著凝集素芯片在檢測活細胞表面糖譜變化中的應(yīng)用來展開。我們從凝集素芯片的構(gòu)建入手，到以白血病細胞分型為目標的原理驗證實驗，最終以不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞為對象，建立了一套以凝集素芯片為基礎(chǔ)，整合了凝集素親和、質(zhì)譜以及其他相關(guān)實驗技術(shù)的整體化實驗方案并成功的鑒定出了與乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的膜糖蛋白以及下游效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。本文的主要結(jié)構(gòu)如下:
　　 在第一章中，我們首先介紹了本文的技術(shù)核心——凝集素芯片技術(shù)及其在分析活細胞表面糖結(jié)構(gòu)

4、方面的優(yōu)勢。這章主要從天然凝集素的結(jié)構(gòu)功能;凝集素芯片的制作工藝，檢測方法和目前應(yīng)用這幾部分進行敘述，詳細地介紹了凝集素芯片技術(shù)這一新興的高通量糖結(jié)構(gòu)檢測技術(shù)對活細胞表面糖譜研究的重要性。
　　 在第二章中，我們以急性髓系白血病細胞分型為目的，對凝集素芯片在腫瘤細胞糖譜分析中的應(yīng)用做了原理性驗證。我們從基片選擇，流程優(yōu)化及結(jié)果分析等幾方面詳細敘述了以凝集素芯片為檢測手段，以活體腫瘤細胞為檢驗對象，進行細胞表面糖譜系分析的方法。最

5、終，我們成功地從91個凝集素中找到了22個凝集素可以有效地區(qū)分四種白血病細胞，說明了本方法在檢測活體腫瘤細胞表面糖譜的可行性。并且我們還嘗試了用長期凍存的白血病細胞樣本來做凝集素芯片分析，結(jié)果證明，在現(xiàn)行的細胞凍存條件下，保存了2個月的樣本可以用作凝集素芯片分析，為日后凝集素芯片在臨床方面的應(yīng)用做了有益的探索。
　　 本次報告的核心內(nèi)容在第三章。在這章中我們建立了一套整合了凝集素芯片技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)這兩項高通量檢測技術(shù)，并輔以穩(wěn)定

6、同位素標記技術(shù)，凝集素親和技術(shù)，實時細胞檢測技術(shù)等幾項關(guān)鍵的相關(guān)技術(shù)的整體化解決方案，用以檢測和分析腫瘤細胞表面差異化表達的糖結(jié)構(gòu)或糖蛋白。我們以不同轉(zhuǎn)移能力的三陰性乳腺癌細胞系為檢測對象，首先利用凝集素芯片找到了與之差異性結(jié)合的凝集素——RCA-I，并通過凝集素富集和穩(wěn)定同位素標記最終找到了KRT8和POTEG/H這兩個在這些細胞表面差異性糖基化的膜蛋白及其下游分別相關(guān)的中間纖維蛋白和微絲蛋白這兩個與細胞運動高度相關(guān)的細胞骨架網(wǎng)絡(luò)。<