γ-H2AX、pATM在潮汕賁門癌中的表達及意義.pdf

1、背景和目的：
　　潮汕地區(qū)是賁門癌(Gastric Cardia Cancer,GCA)高發(fā)區(qū)之一,研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染與賁門慢性炎癥有關(guān),而慢性炎癥中產(chǎn)生的活性氧和活性氮片段(Reactive Oxygen and Nitrogen Species,RONS)以及前列腺素可以通過直接或間接的途徑對DNA造成損傷。其中環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX

2、-2)是催化花生四烯酸生成前列腺素的關(guān)鍵酶。
　　DNA雙鏈斷裂(Double-Strand Breaks,DSBs)是最嚴(yán)重的DNA損傷類型。DSBs發(fā)生后,損傷位點的MRN復(fù)合物(MRE11,NBS1,RAD50)解開DNA雙鏈,將毛細(xì)血管共濟失調(diào)突變蛋白(Ataxia Telangiectasia Mutated,ATM)募集到損傷位點。通過與MRN的相互作用,ATM單體化并自動磷酸化Ser1981位點,形成pATM(Pho

3、sphorylation of ATM),pATM進一步使得組蛋白H2A家族成員X(H2 Ahistone family,member X,H2AX)的Ser139位點被磷酸化形成γ-H2AX(Phosphorylation of H2AX)焦點,γ-H2AX焦點在10-30min達到高峰,pATM在損傷后17min也可以達到高峰,所以,pATM和γ-H2AX在損傷位點的共表達對于DSBs的檢測具有重要的意義。γ-H2AX焦點的形成為D

4、NA損傷修復(fù)蛋白的募集提供了一個平臺,pATM會繼續(xù)磷酸化下游的p53蛋白,發(fā)揮細(xì)胞周期關(guān)卡的作用,使細(xì)胞周期停滯在特殊的階段,為DNA修復(fù)贏得時間。但是,p53蛋白在腫瘤中很容易發(fā)生突變,導(dǎo)致DSBs修復(fù)失敗。所以,DSBs不僅是最嚴(yán)重的DNA損傷類型,也是最難修復(fù),并且是最容易引起細(xì)胞突變的損傷類型。在許多類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了DSBs,表明DSBs與腫瘤存在著密切的關(guān)系。但是,目前,DSBs在賁門癌中的檢測尚沒有報道,并且在賁門癌中研

5、究炎癥介質(zhì)COX-2與DSBs的關(guān)系也屬首次。
　　本實驗主要通過免疫組化Envision二步法檢測γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2在賁門癌手術(shù)切除標(biāo)本不同部位的表達情況,來探討賁門癌和DSBs的關(guān)系;通過對賁門癌及周邊組織進行炎癥分級,探討炎癥與DSBs的關(guān)系。
　　材料和方法：
　　材料：
　　搜集2010-2012年間汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院術(shù)前無放化療的賁門癌配對標(biāo)本150例。分別在每例的癌

6、組織、距離癌組織1-2cm處的癌旁組織、近切緣組織三個部位中,每個部位取兩份樣本:一份用來做石蠟切片,一份用來提取蛋白,做Western blotting。
　　方法：
　　1.HE染色
　　組織學(xué)分型及炎癥程度的分級
　　2.免疫組化Envision二步法染色
　　檢測γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2蛋白的表達情況
　　3.圖像分析法
　　應(yīng)用Leica IM50圖像采集系統(tǒng)和Im

7、age-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對γ-H2AX、pATM、pp53染色結(jié)果進行分析,計算每張切片的陽性標(biāo)記指數(shù)(Labelling Index,LI);對COX-2染色結(jié)果進行分析,測量每張切片的積分光密度(Intergral Optical Density,IOD)。
　　4.統(tǒng)計分析
　　應(yīng)用SPSS15.0對統(tǒng)計結(jié)果進行分析,多個均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA),兩個均數(shù)之間的比

8、較采用T檢驗;不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析(Pearson correlation analysis),炎癥和瘤變等級的分布差異采用卡方檢驗。顯著性標(biāo)準(zhǔn)定位:P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.Western blotting
　　檢測γ-H2AX蛋白在賁門癌、癌旁和近切緣組織中的表達情況。
　　6.Simple同部位標(biāo)記和消除抗體法

9、
　　檢測γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2的共表達。
　　結(jié)果：
　　1.γ-H2AX、pATM、pp53在近切緣組織(N)、癌旁組織(P)、癌組織(CA)中均有陽性表達,且表達率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢:N

10、計學(xué)意義(P=0.001<0.01)。
　　2.γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2隨著上皮內(nèi)瘤變等級的增高,表達率呈增高趨勢,γ-H2AX在三個級別之間表達率的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002<0.01);pATM在三個級別之間表達率的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000<0.01);COX-2在三個級別之間表達率的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001<0.01);pp53無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.γ-H2AX、

11、pATM、pp53、COX-2隨著慢性炎癥等級的增高,表達率呈增高趨勢。γ-H2AX在各組之間表達率的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001<0.01);pATM在各組之間表達率的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002<0.01);COX-2在各組之間表達率的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001<0.01);pp53無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.Pearson相關(guān)分析結(jié)果:慢性炎癥上皮中γ-H2AX和pATM正相關(guān)(r=0.201,P=0.

12、041)。pATM和pp53正相關(guān)(r=0.321,P=0.001);pATM和COX-2正相關(guān)(r=0.250,P=0.012)。
　　結(jié)論：
　　1.賁門癌中DSBs損傷最為嚴(yán)重,癌組織浸潤較深、分化較差的標(biāo)本中損傷較重;癌前病變標(biāo)本中同樣存在著DSBs損傷,隨上皮內(nèi)瘤變程度增加,損傷加重。提示DSBs損傷伴隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　2.DSBs損傷的程度隨著炎癥程度以及上皮內(nèi)瘤變程度的加重而加重;并且距離癌

13、組織越近,炎癥程度越嚴(yán)重。提示賁門癌可以對周邊組織產(chǎn)生影響,引起炎癥反應(yīng),造成DSBs損傷,進而促進上皮的異型增生。
　　3.隨著炎癥等級,以及上皮內(nèi)瘤變程度的增加,COX-2的陽性率越來越高;COX-2的表達與pATM的表達存在著正相關(guān)的關(guān)系。提示炎癥反應(yīng)中COX-2可能通過與pATM的相互作用,影響了DSBs損傷的修復(fù)。
　　4.本次實驗進一步驗證了pATM在DSBs損傷修復(fù)通路中的關(guān)鍵性作用:pATM同DSBs檢測點蛋