血管緊張素2型受體誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞(EJ)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤的。它在中國(guó)有很高的發(fā)病率。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、放療和化療，化療的價(jià)值有一定的局限性，這是因?yàn)榛煏?huì)傷害正常細(xì)胞并導(dǎo)致復(fù)發(fā)率增高。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，基因治療現(xiàn)如今已成為一種治療膀胱癌的新的策略。
　　 血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)中的一種生物活性肽，它通過(guò)與某些特定器

2、官的AT1受體(AT1R)和AT2受體(AT2R)結(jié)合，調(diào)控心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和組織的生長(zhǎng)。AT2R在胚胎組織中高度表達(dá)，而在人體出生后其表達(dá)急劇降低。當(dāng)心血管系統(tǒng)或者神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時(shí)，AT2R會(huì)在修復(fù)組織損傷的過(guò)程中重新表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)AT2R具有抑制細(xì)胞周期的功能，它可能在癌癥中能夠發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。提高AT2R在多種癌細(xì)胞系，例如前列腺癌、肺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌等細(xì)胞系中的水平，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且癌細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受到抑

3、制。
　　 在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，用表達(dá)AT2R的重組腺病毒載體將AT2R導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞中，以此來(lái)提高AT2R的表達(dá)水平，通過(guò)Q-PCR，流式細(xì)胞分選，凋亡染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢驗(yàn)AT2R的過(guò)度表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期和凋亡的作用，并進(jìn)一步探討其可能的細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制。
　　 方法與材料
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 1.1 復(fù)蘇
　　 把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)。液體都融化后，拿出

4、來(lái)噴灑酒精后放到超凈工作臺(tái)里。把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。
　　 1.2 傳代
　　 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80％-90％時(shí)要傳代。把原有培養(yǎng)基吸掉，加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福?-2分鐘，細(xì)胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吹打

5、細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來(lái)。把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來(lái)。移入培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2.重組腺病毒制備我們采用以下兩種重組腺病毒載體，一種是腺病毒載體包含被巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制的增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(Ad-CMV-EGFP)，而另一種腺病毒載體包含AT2R基因和被巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制的增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(Ad-G-AT2R-EGFP)。
　　 293T

6、細(xì)胞接種于150mm2的組織培養(yǎng)皿中。感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI，virus/cell)為10的重組腺病毒載體被轉(zhuǎn)到入293T細(xì)胞中。36至48小時(shí)后可觀察細(xì)胞病變。通過(guò)凍融和兩個(gè)氯化銫密度梯度的超速離心進(jìn)行提純，根據(jù)腺病毒DNA的OD260nm和OD280nm計(jì)算病毒顆粒和純度，并通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。
　　 3.測(cè)量提取RNA的濃度用含AT2R的腺病毒感染EJ細(xì)胞，48小時(shí)后，收

7、集細(xì)胞，依據(jù)TRIZOL試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取RNA。之后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及RNA在260nm和280nm的OD值。
　　 4.檢測(cè)AT2R的表達(dá)我們從兩個(gè)方面去觀察，(1)，腺病毒感染膀胱癌(EJ)細(xì)胞后，分別在24h、48h、72h通過(guò)熒光顯微鏡觀察膀胱癌細(xì)胞，是否有綠色熒光蛋白的高效表達(dá)。(2)，運(yùn)用QPCR的技術(shù)，在腺病毒（含有Ad-G-AT2R-EGFP），對(duì)照組腺病毒(Ad-CMV-EGFP)，感染膀

8、胱癌細(xì)胞48小時(shí)后。按照TRIZOL使用說(shuō)明書(shū)，提取膀胱癌細(xì)胞RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄成CDNA，AT2R引物為5'-CCACCCTTGCCACTACTAGCA-3';5'-CATTGTTGCCAGAGAT GTTCACA-3'.然后使用熒光定量PCR技術(shù)，其目的是為了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AT2的表達(dá)水平。
　　 5.AT2R基因?qū)J細(xì)胞形態(tài)的影響膀胱癌細(xì)胞（EJ細(xì)胞系，106/ml每孔）被接種于150mm2的組織培養(yǎng)皿中。第二天，Ad

9、-CMV-EGFP或Ad-G-AT2R-EGFP被轉(zhuǎn)導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞中。細(xì)胞培養(yǎng)液為添加10％FBS的DMEM。24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞被用于凋亡試驗(yàn)。
　　 6.AT2R基因?qū)J細(xì)胞周期的影響。
　　 膀胱癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)腺病毒感染后48小時(shí)，胰酶消化，懸浮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)PBS洗滌和離心后，用冰凍的70％乙醇固定至少18小時(shí)。然后放置于保持室溫的暗室中，細(xì)胞在300μL的0.1％PI(50

10、mg/L propridium iodide，0.1％ sodium-citrate，0.1％tritonX-100)中再次懸浮30分鐘。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和ModFit LT software(Verity)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
　　 7.AT2R基因?qū)J凋亡的影響為檢測(cè)凋亡的細(xì)胞，在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞48小時(shí)后，我們依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL凋亡染色試驗(yàn)。細(xì)胞核中如果具有棕色顆粒的細(xì)胞為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。如果細(xì)胞核中未有棕色顆

11、粒的細(xì)胞為T(mén)UNEL陰性細(xì)胞，即未發(fā)生凋亡細(xì)胞。
　　 8.蛋白印跡試驗(yàn)收集細(xì)胞樣本進(jìn)行蛋白印跡試驗(yàn)(Western blot)。使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并且離心以獲得含有蛋白質(zhì)的上清液。測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，然后依據(jù)蛋白印跡試驗(yàn)說(shuō)明書(shū)知道，經(jīng)行蛋白印跡試驗(yàn)，其中一抗包括抗p38 MAPK抗體、抗磷酸化P38(PP38)、抗P53抗體、抗磷酸化P53(pp53)抗體和抗激活的caspase3抗體。這些抗體從Cell Signalin

12、g Technology購(gòu)得?？功录?dòng)蛋白抗體和二抗從Sigma-Aldrich購(gòu)得。
　　 9.siRNA干擾P38、P53我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，干擾膀胱癌細(xì)胞(EJ細(xì)胞)P38、P53的合成，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的膀胱癌細(xì)胞(EJ)，傳代培養(yǎng)后24小時(shí)，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將P38、P53干擾RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，沉默P38、P53基因，24小時(shí)后，加入腺病毒Ad-CMV-EGFP、Ad-G-AT2-EGFP.觀察沉默P38、P

13、53是否會(huì)對(duì)AT2R過(guò)表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞凋亡是否會(huì)產(chǎn)生影響，以明確AT2R過(guò)表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞凋亡是否是通過(guò)P38、P53路徑導(dǎo)致。
　　 10.數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)是用三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的mean±SE表示。通過(guò)單因素或雙因素方差分析并根據(jù)邦弗朗尼(Bonferroni)事后檢驗(yàn)法來(lái)比較每個(gè)平均值，從而來(lái)分析數(shù)據(jù)的顯著性。由于P＜0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)具有顯著差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組腺病毒載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種重組腺

14、病毒載體(Ad-CMV-EGFP，Ad-G-AT2R-EGFP)通過(guò)兩個(gè)氯化銫密度梯度超速離心進(jìn)行提純，檢測(cè)其OD260，計(jì)算其密度分別為1×109和1.2×109，并且純度良好(OD260/OD280＞1.3)。熒光顯微鏡圖顯示EJ細(xì)胞轉(zhuǎn)入了Ad-G-AT2R-EGFP(10 ifu/cell)，Ad-CMV-EGFP(10 ifu/cell)48小時(shí)后，熒光活性均高，而轉(zhuǎn)入了Ad-G-AT2R-EGFP(100 ifu/cell)則

15、顯示出明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，這樣可能存在病毒對(duì)EJ細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)照組Ad-CMV-EGFP(10ifu/cell)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并無(wú)細(xì)胞數(shù)量減少或者凋亡的現(xiàn)象發(fā)生，這表明，10MOI值的腺病毒對(duì)膀胱細(xì)胞癌(EJ)的生長(zhǎng)并無(wú)太大影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，10ifu/cell為腺病毒感染EJ細(xì)胞最適合濃度。EJ細(xì)胞對(duì)腺病毒具有高度敏感性，并且隨著病毒量的不斷加大，其轉(zhuǎn)染率也不斷提高。當(dāng)病毒量為10 MOI時(shí)，轉(zhuǎn)染率達(dá)就可達(dá)到90％以上。但

16、當(dāng)病毒量繼續(xù)升高達(dá)到100 MOI時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到一定程度的病毒抑制。據(jù)此我們確定10 MOI為以下實(shí)驗(yàn)的最佳感染劑量（既可達(dá)到較高感染率，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成明顯影響）。
　　 2.測(cè)量提取RNA的濃度細(xì)胞培養(yǎng)48h后，通過(guò)TRizol提取RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及RNA在260nm和280nm的OD值。測(cè)得Ad-CMV-EGFP為0.75ug/ulOD260/OD280=1.95,Ad-G-AT2-EGF

17、P為0.8 ug/ul OD260/OD280=1.92。說(shuō)明所提取的RNA純度較好，為進(jìn)一步的QPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 3.AT2在腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞后的表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP的實(shí)驗(yàn)組膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的AT2的含量明顯高于轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-CMV-EGFP的對(duì)照組膀胱癌細(xì)胞。這表示，我們的載體是構(gòu)建成功，并且成功制備了含有AT2基因的腺病毒。
　　 4.在EJ細(xì)胞中AT

18、2R高表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的作用通過(guò)細(xì)胞周期分析顯示，與轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-CMV-EGFP(10 ifu/cell，24 hours)的EJ細(xì)胞即對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)了Ad-G-AT2R-EGFP(10 ifu/cell，24 hours)的膀胱癌細(xì)胞中，處于G1期的細(xì)胞明顯增加，處于S期的細(xì)胞增加不明顯。處于G2期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　 5.膀胱癌細(xì)胞中AT2R過(guò)度表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)入Ad-G-AT2R-EGFP

19、兩天后，與轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-CMV-EGFP的對(duì)照組細(xì)胞相比，出現(xiàn)了大量凋亡的細(xì)胞。運(yùn)用TUNEL法可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-G-AT2R-EGFP的細(xì)胞中存在凋亡的細(xì)胞，即那些細(xì)胞核中含有棕色顆粒的細(xì)胞。
　　 可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-G-AT2R-EGFP的細(xì)胞中觀察到細(xì)胞毒性，這些細(xì)胞中有大量細(xì)胞死亡（n=3次試驗(yàn)），而轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-CMV-EGFP的細(xì)胞中出現(xiàn)極少數(shù)死亡細(xì)胞（n=3次試驗(yàn)）。
　　 6.AT2R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否通過(guò)p38

20、MAPK和Caspase-3信號(hào)通路？蛋白印跡試驗(yàn)的結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞43kDa的蛋白質(zhì)與抗磷酸化p38 MAPK(pp38)反應(yīng)。與轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-CMV-EGFP的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-G-AT2R-EGFP的細(xì)胞的p38 MAPK，pp38 MAPK水平并無(wú)明顯變化。與對(duì)照組細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-G-AT2R-EGFP的細(xì)胞的pp53等活性均輕微增高。轉(zhuǎn)導(dǎo)AD-G-AT2-EGFP的細(xì)胞的P53與轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-CMV-EGFP相比較而言變化不

21、大，沒(méi)有顯著差異。與對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-G-AT2-EGFP的膀胱癌細(xì)胞中，caspase-3條帶明顯多于對(duì)照組Ad-CMV-EGFP的條帶。
　　 7.siRNA干擾P38、P53干擾膀胱癌細(xì)胞(EJ細(xì)胞)P38、P53的合成后，我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)AT2R過(guò)表達(dá)產(chǎn)生膀胱癌細(xì)胞凋亡，并無(wú)明顯改變，細(xì)胞生長(zhǎng)依舊受到抑制，細(xì)胞凋亡依舊存在。經(jīng)過(guò)雙盲法在計(jì)算機(jī)下計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)，與未被沉默掉P38、P53的癌細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞數(shù)目基

22、本相似。
　　 結(jié)論與討論:
　　 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的一種。與傳統(tǒng)治療方法相比，基因治療現(xiàn)在已經(jīng)成為一種新的方法。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在調(diào)控癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期方面發(fā)揮著重要的作用。血管緊張素Ⅱ的2型受體(AngⅡ type2 receptors，AT2R)在前列腺癌、肺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌細(xì)胞等癌細(xì)胞中具有抑制生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞周期的功能。為了進(jìn)一步研究AT2R在膀胱癌細(xì)胞中所起的作用，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室構(gòu)建了表達(dá)A

23、T2R的重組腺病毒載體，這些載體通過(guò)腺病毒被導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞株（EJ細(xì)胞株），這樣可以導(dǎo)致AT2R在細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)。通進(jìn)一步分析表明在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的膀胱癌細(xì)胞株中，AT2R水平是有所提高的，在細(xì)胞周期的分析中，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯，尤其是S期的細(xì)胞明顯減少，而G1的細(xì)胞有所增多;另外，AT2R的過(guò)度表達(dá)還誘導(dǎo)了EJ細(xì)胞的凋亡。根據(jù)蛋白印跡試驗(yàn)和反轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT2R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能與p38絲裂原激活蛋白激酶，caspase-3和p

24、53的激活并無(wú)相關(guān)。AT2R誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制，還需要更進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)存在以下優(yōu)點(diǎn)，第一，首次報(bào)道了AT2R過(guò)表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞凋亡。這為膀胱癌的基因治療，提供了一種新的思路。第二，本實(shí)驗(yàn)在病毒量10MOI值時(shí)，就對(duì)膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凋亡作用，這對(duì)未來(lái)研究AT2R過(guò)表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞凋亡提供了毒性小，感染能力高，病毒含量低等優(yōu)良的載體。第三，我們實(shí)驗(yàn)成功的把AT2R與膀胱癌相結(jié)合。并發(fā)現(xiàn)其凋亡通路并非通過(guò)傳統(tǒng)的P38，