木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxydans）中幾種β-內(nèi)酰胺酰化酶的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素是非常有效的抗細(xì)菌感染類藥物，占全球抗生素市場約65％的份額，銷售額約150億美元。在經(jīng)濟(jì)和環(huán)境需求的驅(qū)動下，β-內(nèi)酰胺?；副辉絹碓綇V泛地應(yīng)用于半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的工業(yè)生產(chǎn)。β-內(nèi)酰胺類抗生素?；父鶕?jù)底物的不同，主要分為青霉素?；负皖^孢菌素酰化酶，工業(yè)上通常用作水解發(fā)酵產(chǎn)物(青霉素G和頭孢菌素C)產(chǎn)生抗生素母核，同時(shí)也可以應(yīng)用于半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的合成催化反應(yīng)。盡管β-內(nèi)酰胺?；傅难芯恳验_展多

2、年并取得進(jìn)展，但基礎(chǔ)性的深入研究和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用所必需的優(yōu)良酶類仍然缺乏。 我們圍繞β-內(nèi)酰胺?；搁_展研究，首先探索了產(chǎn)生菌株的篩選、鑒定。篩選指示物采用由頭孢菌素C側(cè)鏈和其模擬母核構(gòu)成、對去?；叨让舾械幕衔?，即本實(shí)驗(yàn)室合成的兩種β-內(nèi)酰胺類抗生素的模擬底物6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)和戊二酰-2-硝基-5-氨基苯甲酸(GL-NABA)。從數(shù)千株極地和海洋微生物中成功地篩選到兩株可能的β-內(nèi)酰胺酰化酶產(chǎn)

3、生菌，它們可分解青霉素G?；父咛禺愋阅M底物6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)。同時(shí)，對一株本室篩選得到的β-內(nèi)酰胺?；府a(chǎn)生菌株(SP650)進(jìn)行了形態(tài)觀察和生化分析，菌株鑒定為木糖氧化無色桿菌木糖氧化亞種(Achromobacterxylosxidans subsp．xylosoxidans)。該菌具有水解青霉素、頭孢菌素和其他類似底物的能力，至少可產(chǎn)生三種β-內(nèi)酰胺酰化酶，是少見的可以同時(shí)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺?；傅木?/p>

4、。 從獲得的木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)中克隆得到一種新型的青霉素G?；富?，標(biāo)記為PGA650。該基因的開放閱讀框有2586bp，GC含量高達(dá)68.72％，是目前已知的GC含量最高的青霉素G酰化酶基因。PGA650?；概c研究較為透徹的來源于Providence rettgeri,Kluyvera citrophila和E. coli青霉素G酰化酶具有超過50％的同源性。對同源建模

5、構(gòu)建的PGA650結(jié)構(gòu)模型的分析發(fā)現(xiàn)，PGA650的分子表面分布大量精氨酸殘基，預(yù)測PGA650具有高熱穩(wěn)定的特性。PGA650的最適反應(yīng)溫度是60℃，在55℃的半衰期是來源于Alcaligeenesfaecali的青霉素G酰化酶四倍，而Alcaligenes faecalis青霉素G?；甘侵耙褕?bào)道的熱穩(wěn)定最高的青霉素?；浮GA650活力維持的pH范圍較廣，它的最適反應(yīng)pH為8.5左右，但即使降低到pH5.3，也還有85％以上的

6、活力，并且具有較高的酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。酸性條件有利于所催化的反應(yīng)向合成方向進(jìn)行并有助于合成反應(yīng)底物和產(chǎn)物的穩(wěn)定，很有應(yīng)用價(jià)值，因此酸性高活力和穩(wěn)定性是PGA650的另一個特點(diǎn)。我們從同源結(jié)構(gòu)建摸和氨基酸組成兩個方面比較分析決定PGA650強(qiáng)熱穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)了PGA650分子內(nèi)部有較多的鹽鍵、較低的天冬酰胺和谷氨酰胺含量、顯著高的精氨酸和脯氨酸含量、α亞基N-和C-末端額外的殘基序列等性質(zhì)，推斷是其高熱穩(wěn)定性的主要決定因素。對動

7、力學(xué)控制的PGA650酶促合成β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢氨芐)，進(jìn)行了精確測定。PGA650催化的頭孢氨芐合成產(chǎn)量顯著高于被認(rèn)為最適合用做β-內(nèi)酰胺類抗生素合成的E.coli青霉素G?；?，而且具有較高的底物特異性，較適合進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類抗生素的合成催化。因此，PGA650所獨(dú)有的高穩(wěn)定性和在酸性環(huán)境下的高活性的特性，使之具有更適合于β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)生產(chǎn)的潛在優(yōu)勢。 利用頭孢菌素的模擬底物從木糖氧化無色桿菌(Achromob

8、acterxylosoxidarts)克隆到另外一種具有廣底物譜的新型?；富?，命名為ana。對該基因進(jìn)行了測序并在大腸桿菌中高表達(dá)和純化。序列分析的結(jié)果表明，Ana是典型的?；笜?biāo)記家族的成員，GC含量高達(dá)71％。?；笜?biāo)記家族通常含有高度保守的約130個氨基酸序列(富含絲氨酸和甘氨酸)，催化三連體的活性中心完全保守。對包含ana基因在內(nèi)的3.4kb的插入片斷進(jìn)行測序及遺傳背景分析，推斷Ana和其同源?；负苡锌赡芫褪寝D(zhuǎn)位子的一部分

9、。有趣的發(fā)現(xiàn)是，與Ana同源性很高的?；复蠖紒碓从诳蓪?dǎo)致肺部慢性感染的致病菌，如Bordetellabronchiseptica，Bordetella pertussis，Mycobacterium tuberculosis H37RV，Mycobacterium leprae，Rhodopseudomonas palustris和Rhodobacter sphaeroides。Ana的底物譜廣泛，能夠水解多個頭孢菌素酰化酶的底物類似