β-內(nèi)酰胺?；缸约羟袡C(jī)制及其突變株的構(gòu)象變化.pdf

1、頭孢菌素?；?CA)和青霉素G酰化酶(PGA)可用于生產(chǎn)重要的制藥中間體，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。這兩個(gè)β內(nèi)酰胺?；竿瑢儆贜端親核(Ntn)水解酶超家族，擁有一個(gè)Ntn活性中心以及一個(gè)特征性的αββα核心結(jié)構(gòu)區(qū)。早期的研究已提出了這類(lèi)酶水解底物的分子機(jī)制:即由β亞基N端的Ntn活性中心Serβ1的側(cè)鏈羥基負(fù)責(zé)親核進(jìn)攻，同時(shí)它的α氨基作為廣義堿參與質(zhì)子傳遞。此外還發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)酶還需兩步自剪切成熟過(guò)程，并釋放出一條前體肽。第一步自剪切的機(jī)理較

2、為明確，然而第二步自剪切的機(jī)制尚有爭(zhēng)論。
　　本研究首先針對(duì)CA的第二步自剪切機(jī)制展開(kāi)研究，通過(guò)高分辨質(zhì)譜分析慢剪切突變、切點(diǎn)移動(dòng)突變和前體肽縮短突變，確認(rèn)了CA的第二步剪切位點(diǎn)為Glu159-Gly160，并且Glu是重要的識(shí)別位點(diǎn)而Gly的短側(cè)鏈能減少空間位阻。通過(guò)分析自剪切的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，第二步剪切反應(yīng)與底物水解反應(yīng)的相似性以及新發(fā)現(xiàn)的?；拿富钚院屯馇须拿富钚?，提出了分子內(nèi)Ntn反應(yīng)理論，即第二步自剪切反應(yīng)是在一個(gè)酶分子

3、內(nèi)由其自身的Ntn活性中心Serβ1進(jìn)行催化的，解決了存在已久的關(guān)于這步自剪切反應(yīng)機(jī)制的爭(zhēng)論。同時(shí)，結(jié)合前體肽縮短突變的蛋白仍可進(jìn)行自剪切的現(xiàn)象，表明第二步自剪切切點(diǎn)可以通過(guò)構(gòu)象變化跨越22(A)的距離與Ntn活性中心接近并完成催化，進(jìn)一步支持了分子內(nèi)Ntn反應(yīng)機(jī)制，并揭示了該酶動(dòng)態(tài)催化過(guò)程。
　　對(duì)前體肽縮短且活性中心滅活(Sβ1A)的突變0aaS1A、2aaS1A以及4aaS1A的晶體學(xué)研究表明，突變后的結(jié)構(gòu)存在較大的勢(shì)能變化

4、，足以克服水解反應(yīng)和第二步自剪切反應(yīng)的活化能能壘，說(shuō)明了酶的構(gòu)象變化對(duì)催化反應(yīng)有重要貢獻(xiàn)。
　　對(duì)CA和PGA及突變蛋白的溴代化合物標(biāo)記研究表明，溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸(BAc-7-ACA)、溴丙酰-7-氨基頭孢烷酸(BPr-7-ACA)及溴乙酰-丙氨酰-脯氨酸(BAc-AP)可親和標(biāo)記CA，而B(niǎo)Ac-7-ACA，BPr-7-ACA和溴乙酰-6-氨基青霉烷酸(BAc-6-APA)可親和標(biāo)記PGA。這些溴代母核類(lèi)似物的親和標(biāo)記過(guò)程

5、反映了底物母核部分與酶的相互作用，而與底物側(cè)鏈類(lèi)似物苯甲基磺酰氟(PMSF)的親和標(biāo)記作用不同。但兩類(lèi)抑制劑都標(biāo)記在了CA和PGA的Ntn活性中心Serβ1的側(cè)鏈羥基上，因此支持了關(guān)于Ntn反應(yīng)機(jī)制的經(jīng)典理論。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)αββα核心結(jié)構(gòu)區(qū)中的突變Sβ3M與Aβ5M對(duì)CA的酶活產(chǎn)生了影響，這些突變離底物結(jié)合區(qū)及活性中心都較遠(yuǎn)，這種影響反映了αββα核心結(jié)構(gòu)區(qū)對(duì)Ntn反應(yīng)的重要性，解釋了其進(jìn)化上的保守性。
　　通過(guò)以上對(duì)CA和PG