三個(gè)新的精子發(fā)生相關(guān)基因在人和小鼠睪丸中的表達(dá)特征.pdf

1、目的：睪丸的精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分裂分化過(guò)程，是一系列基因按時(shí)空順序表達(dá)與睪丸組織內(nèi)外環(huán)境共同作用的結(jié)果。許多在睪丸中特異或高度表達(dá)的基因參與這一過(guò)程。
　　 本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，選擇三個(gè)差異表達(dá)的基因TSG23，T279 和TSC21 進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)上述三種基因進(jìn)行生物信息學(xué)，mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)特性，及在正常和無(wú)精癥睪丸中的表達(dá)差異分析，探討它們?cè)诰影l(fā)生過(guò)程中的作用，為男性不育癥的診斷和治療提供新的思

2、路和方法。
　　 方法：(1) 應(yīng)用芯片技術(shù)篩選精子發(fā)生相關(guān)基因。(2) 應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析TSG23和T279基因和編碼蛋白的理化結(jié)構(gòu)。(3) 應(yīng)用PCR方法檢測(cè)TSG23和T279基因在人和小鼠多組織中及在小鼠不同發(fā)育階段睪丸組織和不同小鼠生殖細(xì)胞系中的表達(dá)特征；比較它們?cè)谡２G丸及無(wú)精癥睪丸中的表達(dá)差異。(4) 制備TSG23、T279和TSC21基因的RNA探針，采用原位雜交的方法檢測(cè)睪丸組織中mRNA的表達(dá)。(5)

3、 構(gòu)建小鼠pEGFP-N1-T279重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，確定T279蛋白的亞細(xì)胞定位。(6) 構(gòu)建人pET32a-T279和TSC21表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)并純化T279和TSC21蛋白；免疫小鼠，制備抗人的TSC21多克隆抗體和T279單克隆抗體；應(yīng)用合成的人多肽抗原免疫小鼠制備TSG23多克隆抗體。(7) Western Blot檢測(cè)TSG23和T279蛋白和抗體的特異性。(8) 免疫熒光方法檢測(cè)T279

4、在人睪丸組織中的表達(dá)。(9) 應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)TSG23、T279和TSC21蛋白在睪丸組織中的表達(dá)定位，并檢測(cè)它們?cè)谡Ｈ瞬G丸組織和生精阻滯患者睪丸組織中的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：(1) 表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示TSG23 和T279 基因在成人睪丸中高表達(dá)，在小鼠睪丸中于18 日齡睪丸中開(kāi)始表達(dá)，且隨年齡逐漸升高。(2) 人TSG23 定位在20q13.12，cDNA 全長(zhǎng)752bp，編碼227 個(gè)氨基酸。小鼠TSG23 定位

5、在2H3，cDNA 全長(zhǎng)755bp，編碼226 個(gè)氨基酸。人T279 定位于13q34，cDNA 全長(zhǎng)773 bp，編碼195 個(gè)氨基酸。小鼠T279 定位于8A2，cDNA 長(zhǎng)度761bp，編碼182 個(gè)氨基酸。TSG23 和T279 皆為人—小鼠同源基因。(3) PCR 結(jié)果顯示TSG23 和T279 為睪丸組織特異性表達(dá)。小鼠TSG23 和T279 僅在出生后15 天的睪丸組織中開(kāi)始表達(dá)，且隨著年齡的增加逐漸增強(qiáng)，TSG23 在S

6、ertoli 細(xì)胞，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞系中均沒(méi)有表達(dá)，而T279 僅在精母細(xì)胞系中表達(dá)。與正常睪丸組織比較，TSG23 和T279 基因在無(wú)精癥睪丸組織的表達(dá)減弱或消失。(4) 成功制備TSG23、T279和TSC21 的正義和反義探針。原位雜交顯示人和小鼠睪丸生精上皮的精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞內(nèi)存在TSG23 的強(qiáng)陽(yáng)性雜交信號(hào)，并呈現(xiàn)階段特異性表達(dá)模式。小鼠T279mRNA 主要定位于靠近管腔的精子細(xì)胞及精子中，精母細(xì)胞也有陽(yáng)性信號(hào)，T

7、SC21 mRNA 定位于小鼠精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的胞漿中。(5) 熒光顯微鏡觀察T279 融合蛋白定位在精母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。(6) 成功制備人TSG23、T279 和TSC21 的鼠源性抗體。(7) Western Blot 結(jié)果顯示TSG23 蛋白只在睪丸組織中識(shí)別出約23KD 大小的特異性條帶，T279 蛋白在睪丸組織中識(shí)別出約22KD 大小的特異性條帶，而在其他組織中兩者均為檢測(cè)到條帶。(8) 免疫熒光結(jié)果表明T279 蛋白主要在

8、正常人睪丸組織的精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中表達(dá)。(9) 免疫組化結(jié)果顯示在正常睪丸中TSG23、T279 和TSC21 蛋白主要在精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中表達(dá)，且TSG23 主要表達(dá)于生精過(guò)程中的Ⅲ和Ⅴ期，而在Ⅰ和Ⅱ期中表達(dá)很低。在生精阻滯的無(wú)精癥患者中三個(gè)蛋白表達(dá)均減弱或消失。
　　 結(jié)論：(1) TSG23、T279和TSC21均為睪丸特異性高表達(dá)基因，且是人—小鼠同源性基因。在小鼠睪丸組織中的表達(dá)呈年齡依賴性升高。(2) T