中國(guó)人肺鱗癌nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、1.目的 肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一,近年來(lái),在我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率均有明顯增長(zhǎng).肺鱗癌是肺癌中最為常見(jiàn)的類型,約占肺癌手術(shù)切除標(biāo)本的6096以上.在肺鱗癌中,淋巴道轉(zhuǎn)移是最常見(jiàn)且較為早期的擴(kuò)散途徑,也是腫瘤患者致死的重要原因.因此,揭示肺鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制,對(duì)該病的治療及預(yù)后具有重要的臨床意義. 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多步驟的復(fù)雜過(guò)程,其中涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活.基因遺傳不穩(wěn)定性,如基

2、因的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability,MSI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)可能是引起抑癌基因失活,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子事件.nm23H1基因作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,類似于其他抑癌基因,它的失活可使其編碼的蛋白NDPK(核苷酸二磷酸激酶)表達(dá)減少,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移. 目前對(duì)中國(guó)人nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性如何參與肺鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究

3、,仍鮮見(jiàn)報(bào)道.本課題應(yīng)用熒光PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(FPCR-SSCP)方法、免疫組織化學(xué)染色法等方法,檢測(cè)肺鱗癌nm23H1基因5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI和LOH以及nm23H1蛋白的表達(dá),分析該基因位點(diǎn)遺傳不穩(wěn)定性對(duì)肺鱗癌蛋白表達(dá)及其進(jìn)展的影響,以便為肺鱗癌臨床治療和預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 2.材料與方法 2.1標(biāo)本新鮮肺鱗癌手術(shù)標(biāo)本50例,其中男性47例,女性3例.每例均包括腫瘤組織和周圍正常組織.每例標(biāo)本均作冰

4、凍切片由病理醫(yī)師予以確診,并確保每例腫瘤標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞比例在80﹪以上. 2.2引物和抗體nm23Hl基因5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列:5'TAT GAG TTC AAC TAC GCACG 3'和5'CTC GAG CAC AGG AGC AGG GTT 3'.鼠抗人nm23H1蛋白單克隆抗體. 2.3基因組DNA的抽提按照試劑盒提供的方法,提取腫瘤組織基因組DNA.同時(shí),抽提患者腫瘤周圍正常組織基因組DNA作為

5、對(duì)照. 2.4熒光PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法(FPCR-SSCP)引物經(jīng)熒光標(biāo)記后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星片斷(110bp-120bp).將PCR產(chǎn)物行毛細(xì)管電泳,同時(shí)采用Genescan分析軟件給出電泳圖譜. 2.5免疫組織化學(xué)染色常規(guī)石蠟切片,脫蠟后行nm23Hl蛋白免疫組織化學(xué)法染色,DAB顯色,鏡下控制顯色時(shí)間,常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片.同時(shí),采用PBS代替一抗作陰性對(duì)照. 2.6判斷標(biāo)準(zhǔn)以正常組織的電

6、泳圖譜作為對(duì)照,如果在腫瘤組織電泳圖譜上至少有一個(gè)對(duì)應(yīng)峰發(fā)生移位或者峰的數(shù)量增多,則為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI).已為MSI陽(yáng)性的病例不再作LOH的評(píng)價(jià).分別計(jì)算正常組織和腫瘤組織的兩個(gè)主峰之間的峰值比率,然后由正常組織的峰值比率除以腫瘤組織的峰值比率,得到LOH:指數(shù)(LOHindex).如果LOH指數(shù)為≤0.67或≥1.5時(shí)則被認(rèn)為是LOH. 2.7圖像分析每例標(biāo)本連續(xù)選取不重疊的20個(gè)高倍視野,在相同灰度設(shè)定條件下測(cè)出G<,A

7、>(整個(gè)背景視野灰度值)、G(視野內(nèi):nm23Hl蛋白免疫組化陽(yáng)性染色顆粒的灰度值)、A<,Aa>(nm23Hl陽(yáng)性細(xì)胞占視野面積的面積密度). 2.8數(shù)據(jù)處理用Excel函數(shù)算出PU值(positive unit陽(yáng)性單位),代表nm23H1蛋白在肺鱗癌細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度. 2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件包行單因素方差分析(One-way ANOVA)、t檢驗(yàn)和x<'2>檢驗(yàn). 3.結(jié)果

8、 3.1肺鱗癌與MSI、LOH的關(guān)系利用FPCR-SSCP檢測(cè)法,發(fā)現(xiàn)50例肺鱗癌患者中能提供信息的個(gè)體數(shù)(雜合子數(shù))為44例(88﹪),其可用于LOH分析. 44例能提供信息的肺鱗癌患者中MsI和LOH檢出率分別為11.36﹪(5/44)和25.00﹪(11/44), 5例MSI全部發(fā)生在分化良好(G1為2例和G2為3例)及存活患者(1年生存率)中.然而,MSI和LOH的檢出率與肺鱗癌分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、患者生

9、存狀態(tài)及其它臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)(p>0.05). 3.2肺鱗癌與nm23H1蛋白表達(dá)的關(guān)系nm23H1蛋白免疫染色反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色顆粒,主要位于細(xì)胞質(zhì),胞核和胞膜也有陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果.44例肺鱗癌nm23Hl蛋白檢出率為50﹪(22/44).nm23Hl蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在TNM I期(65.22﹪)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(66.67﹪)顯著高于TNM Ⅲ期(18.18﹪)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(30.00﹪)(p<0.05). 3.3

10、MSI、LOH與nm23H1蛋白表達(dá)的關(guān)系nm23H1蛋白在MSI陽(yáng)性組和陰性組的陽(yáng)性檢出率分別為40﹪、51.28﹪,而其在LOH陽(yáng)性組和陰性組的陽(yáng)性檢出率分別為54.55﹪、48.48﹪,但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明MSI和LOH對(duì)nm23H1蛋白表達(dá)均無(wú)影響(p>0.05). 另外,計(jì)算機(jī)圖像定量分析顯示,在各臨床病理參數(shù)影響下,各組nm23H1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度也沒(méi)有差異(p>0.05). 4.結(jié)論 nm23H1蛋白可能

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