馬鈴薯StCOL和StTFL1的克隆及其在塊莖形成中的功能分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。塊莖是馬鈴薯的繁殖器官，也是產(chǎn)品器官。研究馬鈴薯塊莖形成的調(diào)控機制，不僅具有理論價值，而且對馬鈴薯的產(chǎn)量提高具有指導意義.馬鈴薯塊莖形成是一個復雜的生物學過程，并受內(nèi)在因素及外界因素的調(diào)控。最近，有報道將擬南芥的AtCO基因?qū)腭R鈴薯，在短日照條件下，AtCO過表達可以導致塊莖形成減少，說明AtCO對塊莖的形成有負調(diào)節(jié)作用。但是其調(diào)控塊莖形成

2、機制以及內(nèi)源CO在塊莖形成中作用仍不清楚。為了揭示CO在馬鈴薯塊莖形成中的作用，本文克隆了馬鈴薯StCOL、StTFL1和StLFY基因，并通過構(gòu)建StCOL反義抑制和StTFL1過表達轉(zhuǎn)基因植株，初步分析了StCOL和StTFL1對塊莖形成的作用。主要研究結(jié)果如下： 1.克隆了一個馬鈴薯StCOL cDNA序列(DQ882684)、基因組DNA序列及其啟動子。該基因由一個內(nèi)含子和兩個外顯子構(gòu)成，StCOL cDNA序列含有一個

3、1083 bp的開放閱讀框，編碼一個360個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，StCOL分子量為39.21 kD，等電點為5.09。采用DNAMAN對StCOL和其他同源蛋白的氨基酸序列比對，結(jié)果表明StCOL氨基酸序列與擬南芥的AtCO、AtCOL1、AtCOL2和AtCOL3的氨基酸序列具有較高的一致性，在N-和C-末端分別具有保守的B-box和CCT結(jié)構(gòu)域，在蛋白C-末端有一保守的7肽序列(YGVVPSF)；系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明StCO

4、L與豌豆PsCOLb及擬南芥AtCOL3分子的親緣關(guān)系最近；StCOL基因啟動子序列上游有8個TATA-box、4個CAAT-box、1個I-box、4個GATA-box等多個順式作用元件。采用半定量RT-PCR方法對StCOL mRNA水平分析結(jié)果顯示，StCOL在馬鈴薯的根、莖、葉，頂芽、花芽和花中都有表達，其中在葉片中的表達水平最高；對塊莖形成過程中該基因的表達分析結(jié)果顯示，在塊莖形成不同時期都有StCOL表達，在塊莖形成后期表達

5、水平較弱，在成熟塊莖中檢測不到該基因的表達。另外，體外微型薯的暗誘導過程中該基因持續(xù)表達，但該基因的表達水平不受蔗糖和赤霉素的影響。 2.采用RT-PCR和RACE的方法克隆了馬鈴薯StTFL1 cDNA序列(DQ307621)。StTFL1 cDNA序列含有一個528 bp的開放閱讀框，編碼一個由175個氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白分子量為19.86 kD，等電點為8.73，66-88位氨基酸間具有PEBP蛋白典型的特征結(jié)構(gòu)，

6、采用DNAMAN軟件對StTFL1和其他同源蛋白的氨基酸序列比對，結(jié)果表明StTFL1和擬南芥TFL1、水稻CEN及煙草CEN在氨基酸水平有較高的一致性，而且擬南芥的TFL1和馬鈴薯的TFL1的二級結(jié)構(gòu)基本一樣。采用半定量RT-PCR方法對不同組織中該基因的表達水平檢測結(jié)果顯示，StTFL1基因在馬鈴薯的根、莖、葉、頂芽和花芽中均表達，其中在根中的表達水平最高；另外，發(fā)現(xiàn)在塊莖形成的不同時期StTFL1都表達，尤其在匍匐莖形成時有高水平

7、的表達。 3.采用RT-PCR和RACE的方法克隆了馬鈴薯StLFY cDNA序列(EF062357)及基因組DNA序列(EU371047)。該基因由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，StLFY cDNA含有一個1257 bp的開放閱讀框，編碼一個由418個氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白分子量為46.37 kD，等電點為6.18.采用DNAMAN軟件對StLFY和其他同源蛋白的氨基酸序列比對，結(jié)果表明StLFY和AtLFY、NtFL2及

8、SILFY在氨基酸水平有較高的一致性，而且在氨基末端都有一個保守的富含脯氨酸的區(qū)域，半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，StLFY僅在馬鈴薯頂芽和花芽有較弱的表達，而且在匍匐莖初始形成時也有較弱表達。 4.為了進一步了解StCOL和StTFL1與馬鈴薯塊莖形成的關(guān)系，首先優(yōu)化了一簡便的農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯莖段遺傳轉(zhuǎn)化方法：莖段外植體暗中預培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌侵染5-8 min，暗中共培養(yǎng)時間為2 d，轉(zhuǎn)入愈傷誘導和芽分化的培養(yǎng)基(MS+0

9、.5 mg/LTDZ+0.3 mg/L GA3+50 mg/L Kan+200 mg/L Car+200 mg/L Cef)，光照培養(yǎng)4～5周即有不定芽的生成.采用PCR方法驗證轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率約為5％.在此基礎(chǔ)上，進行了StCO L和StTFL1基因的遺傳轉(zhuǎn)化，初步對StCOL和StTFL1在塊莖形成中的作用以及它們之間的關(guān)系進行了分析。短日照條件下，與未轉(zhuǎn)化對照組相比，表達StCOL反義片段的轉(zhuǎn)基因株系葉片中StCOL mRNA水