人工關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨細(xì)胞生物活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:人工關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積氧化鋯膜的制備及其表征檢測(cè)
　　目的：試圖采用磁過(guò)濾真空陰極弧沉積法在鈦金屬假體表面制備氧化鋯膜，并檢測(cè)其表征。方法：采用磁過(guò)濾真空陰極弧沉積法在純鈦片表面制備氧化鋯膜，然后對(duì)氧化鋯膜的形貌特征、化學(xué)組成、相組成等進(jìn)行表征檢測(cè)。結(jié)果：檢測(cè)顯示真空陰極弧沉積制備的氧化鋯膜比較均勻、光滑、致密，具有納米結(jié)構(gòu)的表面。結(jié)論：采用磁過(guò)濾真空陰極弧沉積系統(tǒng)可在純鈦表面制備均勻、致密的氧化鋯膜，制備的氧化鋯膜具有

2、納米結(jié)構(gòu)的表面，陰極弧沉積氧化鋯膜的納米表面結(jié)構(gòu)可能與它的生物活性有關(guān)。
　　第二部分:人工關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞粘附及增殖活性的影響
　　目的：探討陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞粘附及增殖活性的影響。方法：以陰極弧沉積ZrO2膜作為實(shí)驗(yàn)組，純Ti作為對(duì)照組，分別按一定的密度接種MG63細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)1、6、12、24小時(shí)兩組材料表面附著的成骨細(xì)胞數(shù)；掃描電鏡觀察12和24小時(shí)成骨

3、細(xì)胞在兩組材料表面的鋪展情況；鬼筆環(huán)肽熒光染色倒置熒光顯微鏡觀察12和24小時(shí)兩組材料表面細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)。CCK-8法檢測(cè)1、4、7、10天時(shí)兩組材料表面成骨細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：1小時(shí)后，兩組樣品表面MG63細(xì)胞附著的數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6、12和24小時(shí)后，ZrO2膜表面的細(xì)胞數(shù)顯著多于純Ti表面，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示12和24小時(shí)后ZrO2組的細(xì)胞鋪展優(yōu)于

4、Ti組，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示12和24小時(shí)后ZrO2組表面細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)多于Ti組；CCK結(jié)果顯示：培養(yǎng)4天及7天后，ZrO2膜表面的細(xì)胞增殖活性顯著高于純Ti表面，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：人工關(guān)節(jié)假體表面陰極弧沉積制備的氧化鋯膜具有促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附及增殖的能力。
　　第三部分:人工關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞分化表型標(biāo)志物的影響
　　目的：探討陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨樣MG63細(xì)

5、胞分化表型標(biāo)志物的影響。方法：以陰極弧沉積ZrO2膜作為實(shí)驗(yàn)組，純Ti作為對(duì)照組，分別按一定的密度接種MG63細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別于第1、4、7、10天收集標(biāo)本，檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性；以定量RT-PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物堿性磷酸酶、I型膠原（COLI）及骨鈣素（OC）的基因表達(dá)情況；熒光染色倒置熒光顯微鏡觀察4天時(shí)COLI蛋白的表達(dá)；ELISA檢測(cè)1、4、7、10天時(shí)成骨細(xì)胞分泌OC蛋白量。結(jié)果：在培養(yǎng)第1天時(shí)，兩組堿性磷酸

6、酶活性及基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組堿性磷酸酶活性及基因表達(dá)均呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，第4、7、10天時(shí)，ZrO2組堿性磷酸酶活性及基因表達(dá)顯著高于純Ti組（p＜0.05）。第1天時(shí)，且兩組COLI基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；在第4天及7天時(shí)，ZrO2組COLI基因表達(dá)顯著高于純Ti組（p＜0.05），在第10天時(shí)，兩組COLI基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。在第1天和第4天培養(yǎng)時(shí)

7、，兩組OC基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；但在第7天和第10天時(shí)，ZrO2組的OC基因表達(dá)顯著高于純Ti組（p＜0.05）。第4天時(shí)，ZrO2組表面的COLI蛋白合成量多于Ti組。兩組OC蛋白分泌量在第1、4天時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；但在第7、10天時(shí)，ZrO2組OC蛋白分泌量均顯著高于Ti組（p＜0.05）。結(jié)論：陰極弧沉積氧化鋯膜具有提高M(jìn)G63細(xì)胞分化表型標(biāo)志物水平的能力，表明陰極弧沉積氧化鋯膜是一種具有良好生物活性

8、的涂層材料。
　　第四部分:人工關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨細(xì)胞破骨功能相關(guān)基因表達(dá)及蛋白分泌的影響
　　目的：探討人工關(guān)節(jié)假體表面陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨細(xì)胞破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)及蛋白分泌的影響。方法：以陰極弧沉積ZrO2膜作為實(shí)驗(yàn)組，純Ti作為對(duì)照組，分別按一定的密度接種MG63細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別于第1、4、7、10天收集標(biāo)本，以定量RT-PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞破骨細(xì)胞分化相關(guān)的骨保護(hù)素（OPG）和核因子κB受體活

9、化因子配體（RANKL）基因表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)1、4、7、10天時(shí)成骨細(xì)胞分泌OPG和RANKL蛋白量。結(jié)果：第1天及第4天時(shí)，兩組OPG基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；第7天及第10天時(shí)，ZrO2組OPG基因表達(dá)顯著高于Ti組（p＜0.05）。第1天及第4天時(shí)，兩組RANKL基因表達(dá)無(wú)顯著差異（p＞0.05）；在第7天及第10天時(shí)，ZrO2組的基因表達(dá)顯著低于Ti組（p＜0.05）。培養(yǎng)第1天及第4天時(shí)，兩組樣品表面的成骨

10、細(xì)胞OPG蛋白分泌無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；第7天及第10天時(shí)， ZrO2組OPG蛋白分泌顯著高于Ti組（p＜0.05）。第1天及第4天時(shí)，兩組樣品表面的成骨細(xì)胞RANKL蛋白分泌無(wú)顯著差異（p＞0.05）；第7天及第10天時(shí)，ZrO2組的RANKL蛋白分泌顯著低于Ti組（p＜0.05）。結(jié)論：人工關(guān)節(jié)假體表面陰極弧沉積氧化鋯膜能夠上調(diào)成骨細(xì)胞OPG水平，同時(shí)下調(diào)RANKL水平，提高OPG/RANKL相對(duì)比率，從而抑制破骨細(xì)胞的分化

11、和活性。
　　第五部分:人工關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞活性影響的信號(hào)傳導(dǎo)通道研究
　　目的：探討人工關(guān)節(jié)假體表面陰極弧沉積氧化鋯膜對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞活性影響的可能信號(hào)傳導(dǎo)通路。方法：以陰極弧沉積ZrO2膜作為實(shí)驗(yàn)組，純Ti作為對(duì)照組，分別按照一定的密度在表面接種MG63細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別于第6小時(shí)，24小時(shí)，4天，7天后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集標(biāo)本，檢測(cè)整合素β1、FAK、ERK1、ERK2、c-fos及c-ju

12、n的基因表達(dá)。結(jié)果：6、24小時(shí)及4天后，ZrO2組整合素β1基因表達(dá)顯著高于Ti組（p＜0.05）；7天后，兩組整合素β1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。6、24小時(shí)及4天后，ZrO2組FAK基因表達(dá)顯著高于Ti組（p＜0.05）；7天后，兩組FAK基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；6小時(shí)及24小時(shí)后，ZrO2組ERK1基因表達(dá)顯著高于Ti組（p＜0.05）；4天及7天后，兩組ERK1基因表達(dá)無(wú)顯著差異（p＞0.05）。6、24

13、小時(shí)及4天后，ZrO2組ERK2基因表達(dá)顯著高于T組（p＜0.05）；7天后，兩組樣品表面的ERK2基因表達(dá)無(wú)顯著差異（p＞0.05）。6、24小時(shí)、4天及7天后，ZrO2組c-fos基因表達(dá)顯著高于Ti組（p＜0.05）。6、24小時(shí)及4天后，ZrO2組c-jun表達(dá)顯著高于Ti組（p＜0.05）；7天后，兩組樣品表面的c-jun基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。結(jié)論：人工關(guān)節(jié)假體表面陰極弧沉積氧化鋯膜可能通過(guò)整合素介導(dǎo)的MAPK