氧化磷脂對成骨細胞分化的影響及其機制研究.pdf

1、牙周炎是口腔科常見疾病，是導(dǎo)致牙齒早失的主要原因。牙周炎以牙周支持組織包括牙槽骨的破壞為主要病理表現(xiàn)，其治療以重建牙周組織，恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能為目標。同其他部位的骨組織相同，牙槽骨終生處于骨改建中，即成骨細胞的骨生成和破骨細胞的骨吸收形成平衡，二者相對作用的強弱決定骨量的變化。牙周炎發(fā)生時，局部的炎癥反應(yīng)使成骨細胞的骨生成受到抑制，而破骨細胞的骨吸收作用被促進。牙周醫(yī)學(xué)研究表明牙周炎發(fā)生及病變程度與心血管疾病密切相關(guān)，而高脂血癥作

2、為共同的致病因素同時促進了這兩類疾病的發(fā)生。高脂血癥以升高的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-c)，甘油三脂(triglyceride，TG)，總膽固醇(total cholesterol，TC)為主要表現(xiàn)，其中LDL-c升高被認為是心血管疾病的主要致病因素。高脂血癥可引起脂質(zhì)過氧化，LDL的氧化主要發(fā)生在動脈血管壁，產(chǎn)生多種具有生物活性的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，在動脈粥樣硬化斑塊

3、病變發(fā)生中起關(guān)鍵作用。其中低度氧化修飾的LDL(minimally modified LDL，MM-LDL)即LDL不完全氧化的產(chǎn)物，被認為具有更高的促炎能力。研究表明脂質(zhì)氧化產(chǎn)物促進了血管細胞鈣化，而抑制了成骨細胞鈣化，可能是心血管疾病血管鈣化和骨質(zhì)破壞并發(fā)的機制。在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物一方面影響系統(tǒng)炎癥水平和免疫狀態(tài)，增加了機體對牙周炎的易感性;另一方面直接作用于成骨細胞及破骨細胞，促進骨吸收而抑制新骨生成，最終骨密度及

4、骨量降低。研究發(fā)現(xiàn)多種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物參與抑制成骨前體細胞的分化及骨基質(zhì)產(chǎn)生。
　　目的：
　　本實驗研究ox-PAPC是否影響成骨細胞增殖，凋亡和成骨相關(guān)基因表達;同時觀察重要的成骨調(diào)控信號——經(jīng)典Wnt通路是否參與了上述ox-PAPC對成骨分化的影響及具體分子機制。
　　方法：
　　第一部分: ox-PAPC對成骨細胞活性及成骨相關(guān)基因表達的影響
　　取新生小鼠顱骨，分離并培養(yǎng)原代成骨細胞，鑒定后取第二代細

5、胞，常規(guī)培養(yǎng)并以0，15，30μg/ml ox-PAPC刺激，分別于刺激0，24，48，72，96小時用CCK-8法檢測細胞活性;用含5％血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)并以0，15，30μg/ml ox-PAPC刺激48小時，用caspase-3活性檢測評價細胞凋亡。
　　分別培養(yǎng)小鼠原代成骨細胞及MC3T3-E1前成骨細胞系，以成骨培養(yǎng)基，同時以15μg/ml ox-PAPC或PAPC刺激3小時，1天，3天，5天，提取總RNA，采用實時定量反

6、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（real time reverse transcription-polymerchain reaction，real time RT-PCR）技術(shù)分析成骨因子Runx2，oxterix，ALP和OC的表達變化。
　　第二部分:ox-PAPC對經(jīng)典Wnt信號通路及其誘導(dǎo)的成骨分化的影響及作用機制
　　1.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，以20 ng/ml Wnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg

7、/mloxPAPC刺激1天，采用細胞免疫熒光技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測β-catenin的細胞核/漿分布，評價ox-PAPC對經(jīng)典Wnt通路活性水平的影響。
　　2.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，以20 ng/mlWnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg/mloxPAPC刺激2天，檢測細胞內(nèi)ALP活性;刺激2天和3天，采用Western blot法分別檢測Runx2及BSP蛋白水平的變化，以分析ox-PAP

8、C對經(jīng)典Wnt信號誘導(dǎo)的成骨分化的影響。
　　3.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，以15μg/ml ox-PAPC刺激不同時間，采用Westernblot技術(shù)檢測總ERK，總p38 MAPK及p-ERK，p-p38 MAPK水平，研究ox-PAPC刺激后ERK通路及p38 MAPK通路活性的動態(tài)變化;然后以20 ng/ml Wnt-3a和/或15μg/ml ox-PAPC刺激1小時，同樣采用Western blot法檢測總ERK，總p3

9、8MAPK及p-ERK，p-p38 MAPK水平，研究Wnt-3a和ox-PAPC分別對ERK及p38 MAPK通路活性的作用。
　　4.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，以20 ng/ml Wnt-3a，15μg/ml oxPAPC加或不加ERK/p-38 MAPK通路抑制劑刺激細胞，同前述方法檢測成骨因子的表達和活性變化以及經(jīng)典Wnt信號通路的活性變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分:
　　成功分離培養(yǎng)原代小鼠顱骨成骨細

10、胞，并經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色鑒定BSP(+);15和30μg/ml ox-PAPC可促進原代成骨細胞增殖，并促進5％血清培養(yǎng)條件下成骨細胞凋亡;而15μg/ml和30μg/ml濃度組間細胞增殖及凋亡均未見明顯差異。原代成骨細胞及MC3T3-E1細胞，ox-PAPC刺激組成骨相關(guān)因子osterix，Runx2，ALP和OC mRNA表達明顯降低;而PAPC刺激組各基因表達均無明顯變化。
　　第二部分:
　　1.MC3T3-E1對照

11、組細胞核內(nèi)β-catenin表達水平較低，核內(nèi)β-catenin表達陽性細胞較少，經(jīng)典Wnt信號通路未激活;經(jīng)Wnt-3a刺激后，核內(nèi)β-catenin表達陽性的細胞增多，細胞核/漿β-catenin比值升高;Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后，免疫熒光顯示核內(nèi)β-catenin表達陽性的細胞較Wnt-3a單獨處理組減少，western定量結(jié)果顯示細胞核/漿β-catenin蛋白比值較Wnt-3a單獨處理組明顯降低。
　　2.

12、MC3T3-E1以Wnt-3a刺激2天后，ALP活性升高，而以ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激后，ALP活性較Wnt-3a單獨處理組明顯下降。同樣，Wnt-3a刺激2天后Runx2蛋白水平及3天后的BSP蛋白水平升高，ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激組Runx2及BSP水平較Wnt-3a單獨組均明顯降低。
　　3.MC3T3-E1經(jīng)ox-PAPC刺激后，總ERK和總p38 MAPK水平無明顯變化，而p-ERK及p-p38

13、MAPK的相對水平則高于對照組，其升高時間可持續(xù)至刺激后3小時。刺激1小時后，western結(jié)果顯示ox-PAPC刺激明顯升高p-ERK/ERK及p-p38 MAPK/p38 MAPK相對水平，而Wnt-3a對二者均無影響。
　　4.MC3T3-E1經(jīng)Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后，β-catenin核內(nèi)表達陽性的細胞數(shù)較Wnt-3a單獨處理組減少，核內(nèi)表達降低，ALP活性和Runx2，BSP蛋白水平較Wnt-3a單獨處理

14、組明顯下降。以ERK通路抑制劑PD98059與Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激細胞，可以消除上述ox-PAPC對β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制作用，逆轉(zhuǎn)了ox-PAPC引起的ALP活性及Runx2和BSP蛋白表達水平下降，且與Wnt-3a單獨處理組相比無顯著差異。以p38 MAPK抑制劑SB203580與Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激細胞，對β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)移無影響，不能逆轉(zhuǎn)ox-PAPC對Wnt-3a激活的成骨因子

15、表達及活性的抑制作用，反而進一步降低ALP活性及Runx2蛋白表達水平。
　　結(jié)論：
　　1.Ox-PAPC促進原代小鼠成骨細胞增殖，在低血清培養(yǎng)高細胞密度情況下促進細胞凋亡。Ox-PAPC抑制MC3T3-E1細胞及原代成骨細胞內(nèi)成骨相關(guān)因子osterix，Runx2和ALP，OC的mRNA表達;而PAPC對此無明顯抑制作用。氧化磷脂對成骨分化和功能有抑制作用。
　　2.Ox-PAPC抑制Wnt-3a激活的β-cate