2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、牙周炎是口腔科常見疾病,是導(dǎo)致牙齒早失的主要原因。牙周炎以牙周支持組織包括牙槽骨的破壞為主要病理表現(xiàn),其治療以重建牙周組織,恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能為目標。同其他部位的骨組織相同,牙槽骨終生處于骨改建中,即成骨細胞的骨生成和破骨細胞的骨吸收形成平衡,二者相對作用的強弱決定骨量的變化。牙周炎發(fā)生時,局部的炎癥反應(yīng)使成骨細胞的骨生成受到抑制,而破骨細胞的骨吸收作用被促進。牙周醫(yī)學(xué)研究表明牙周炎發(fā)生及病變程度與心血管疾病密切相關(guān),而高脂血癥作

2、為共同的致病因素同時促進了這兩類疾病的發(fā)生。高脂血癥以升高的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-c),甘油三脂(triglyceride,TG),總膽固醇(total cholesterol,TC)為主要表現(xiàn),其中LDL-c升高被認為是心血管疾病的主要致病因素。高脂血癥可引起脂質(zhì)過氧化,LDL的氧化主要發(fā)生在動脈血管壁,產(chǎn)生多種具有生物活性的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物,在動脈粥樣硬化斑塊

3、病變發(fā)生中起關(guān)鍵作用。其中低度氧化修飾的LDL(minimally modified LDL,MM-LDL)即LDL不完全氧化的產(chǎn)物,被認為具有更高的促炎能力。研究表明脂質(zhì)氧化產(chǎn)物促進了血管細胞鈣化,而抑制了成骨細胞鈣化,可能是心血管疾病血管鈣化和骨質(zhì)破壞并發(fā)的機制。在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中,脂質(zhì)氧化產(chǎn)物一方面影響系統(tǒng)炎癥水平和免疫狀態(tài),增加了機體對牙周炎的易感性;另一方面直接作用于成骨細胞及破骨細胞,促進骨吸收而抑制新骨生成,最終骨密度及

4、骨量降低。研究發(fā)現(xiàn)多種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物參與抑制成骨前體細胞的分化及骨基質(zhì)產(chǎn)生。
  目的:
  本實驗研究ox-PAPC是否影響成骨細胞增殖,凋亡和成骨相關(guān)基因表達;同時觀察重要的成骨調(diào)控信號——經(jīng)典Wnt通路是否參與了上述ox-PAPC對成骨分化的影響及具體分子機制。
  方法:
  第一部分: ox-PAPC對成骨細胞活性及成骨相關(guān)基因表達的影響
  取新生小鼠顱骨,分離并培養(yǎng)原代成骨細胞,鑒定后取第二代細

5、胞,常規(guī)培養(yǎng)并以0,15,30μg/ml ox-PAPC刺激,分別于刺激0,24,48,72,96小時用CCK-8法檢測細胞活性;用含5%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)并以0,15,30μg/ml ox-PAPC刺激48小時,用caspase-3活性檢測評價細胞凋亡。
  分別培養(yǎng)小鼠原代成骨細胞及MC3T3-E1前成骨細胞系,以成骨培養(yǎng)基,同時以15μg/ml ox-PAPC或PAPC刺激3小時,1天,3天,5天,提取總RNA,采用實時定量反

6、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(real time reverse transcription-polymerchain reaction,real time RT-PCR)技術(shù)分析成骨因子Runx2,oxterix,ALP和OC的表達變化。
  第二部分:ox-PAPC對經(jīng)典Wnt信號通路及其誘導(dǎo)的成骨分化的影響及作用機制
  1.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,以20 ng/ml Wnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg

7、/mloxPAPC刺激1天,采用細胞免疫熒光技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測β-catenin的細胞核/漿分布,評價ox-PAPC對經(jīng)典Wnt通路活性水平的影響。
  2.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,以20 ng/mlWnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg/mloxPAPC刺激2天,檢測細胞內(nèi)ALP活性;刺激2天和3天,采用Western blot法分別檢測Runx2及BSP蛋白水平的變化,以分析ox-PAP

8、C對經(jīng)典Wnt信號誘導(dǎo)的成骨分化的影響。
  3.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,以15μg/ml ox-PAPC刺激不同時間,采用Westernblot技術(shù)檢測總ERK,總p38 MAPK及p-ERK,p-p38 MAPK水平,研究ox-PAPC刺激后ERK通路及p38 MAPK通路活性的動態(tài)變化;然后以20 ng/ml Wnt-3a和/或15μg/ml ox-PAPC刺激1小時,同樣采用Western blot法檢測總ERK,總p3

9、8MAPK及p-ERK,p-p38 MAPK水平,研究Wnt-3a和ox-PAPC分別對ERK及p38 MAPK通路活性的作用。
  4.培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,以20 ng/ml Wnt-3a,15μg/ml oxPAPC加或不加ERK/p-38 MAPK通路抑制劑刺激細胞,同前述方法檢測成骨因子的表達和活性變化以及經(jīng)典Wnt信號通路的活性變化。
  結(jié)果:
  第一部分:
  成功分離培養(yǎng)原代小鼠顱骨成骨細

10、胞,并經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色鑒定BSP(+);15和30μg/ml ox-PAPC可促進原代成骨細胞增殖,并促進5%血清培養(yǎng)條件下成骨細胞凋亡;而15μg/ml和30μg/ml濃度組間細胞增殖及凋亡均未見明顯差異。原代成骨細胞及MC3T3-E1細胞,ox-PAPC刺激組成骨相關(guān)因子osterix,Runx2,ALP和OC mRNA表達明顯降低;而PAPC刺激組各基因表達均無明顯變化。
  第二部分:
  1.MC3T3-E1對照

11、組細胞核內(nèi)β-catenin表達水平較低,核內(nèi)β-catenin表達陽性細胞較少,經(jīng)典Wnt信號通路未激活;經(jīng)Wnt-3a刺激后,核內(nèi)β-catenin表達陽性的細胞增多,細胞核/漿β-catenin比值升高;Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后,免疫熒光顯示核內(nèi)β-catenin表達陽性的細胞較Wnt-3a單獨處理組減少,western定量結(jié)果顯示細胞核/漿β-catenin蛋白比值較Wnt-3a單獨處理組明顯降低。
  2.

12、MC3T3-E1以Wnt-3a刺激2天后,ALP活性升高,而以ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激后,ALP活性較Wnt-3a單獨處理組明顯下降。同樣,Wnt-3a刺激2天后Runx2蛋白水平及3天后的BSP蛋白水平升高,ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激組Runx2及BSP水平較Wnt-3a單獨組均明顯降低。
  3.MC3T3-E1經(jīng)ox-PAPC刺激后,總ERK和總p38 MAPK水平無明顯變化,而p-ERK及p-p38

13、MAPK的相對水平則高于對照組,其升高時間可持續(xù)至刺激后3小時。刺激1小時后,western結(jié)果顯示ox-PAPC刺激明顯升高p-ERK/ERK及p-p38 MAPK/p38 MAPK相對水平,而Wnt-3a對二者均無影響。
  4.MC3T3-E1經(jīng)Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后,β-catenin核內(nèi)表達陽性的細胞數(shù)較Wnt-3a單獨處理組減少,核內(nèi)表達降低,ALP活性和Runx2,BSP蛋白水平較Wnt-3a單獨處理

14、組明顯下降。以ERK通路抑制劑PD98059與Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激細胞,可以消除上述ox-PAPC對β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制作用,逆轉(zhuǎn)了ox-PAPC引起的ALP活性及Runx2和BSP蛋白表達水平下降,且與Wnt-3a單獨處理組相比無顯著差異。以p38 MAPK抑制劑SB203580與Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激細胞,對β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)移無影響,不能逆轉(zhuǎn)ox-PAPC對Wnt-3a激活的成骨因子

15、表達及活性的抑制作用,反而進一步降低ALP活性及Runx2蛋白表達水平。
  結(jié)論:
  1.Ox-PAPC促進原代小鼠成骨細胞增殖,在低血清培養(yǎng)高細胞密度情況下促進細胞凋亡。Ox-PAPC抑制MC3T3-E1細胞及原代成骨細胞內(nèi)成骨相關(guān)因子osterix,Runx2和ALP,OC的mRNA表達;而PAPC對此無明顯抑制作用。氧化磷脂對成骨分化和功能有抑制作用。
  2.Ox-PAPC抑制Wnt-3a激活的β-cate

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