桑樹miR3954-MuLnc1-ta-siRNA級聯(lián)途徑的鑒定及其功能研究.pdf

1、MiRNA--TAS--ta-siRNA--target gene級聯(lián)途徑是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組分，在植物發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。本研究在桑樹中鑒定到一種新的ta-siRNA合成級聯(lián)途徑：Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA--Mul-CML27，分析了該途徑中各組分的表達(dá)模式和生物功能，在此基礎(chǔ)上通過轉(zhuǎn)基因和植物雜交技術(shù)在擬南芥中建立了Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA級

2、聯(lián)途徑，并對其生物功能和作用機制進(jìn)行了探討，為全面揭示桑樹Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA--target gene級聯(lián)途徑的生物功能和作用機制奠定了基礎(chǔ)，對于豐富植物 ta-siRNA合成級聯(lián)途徑，促進(jìn)桑樹功能基因組學(xué)研究具有重要意義。
　　本文的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）桑樹Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA--target gene級聯(lián)途徑的鑒定
　　通過對桑

3、樹轉(zhuǎn)錄組、sRNA和降解組數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，桑樹mul-miR3954可以靶向一種長鏈非編碼 RNA Mu-Lnc1的轉(zhuǎn)錄本，切割其產(chǎn)生多個以21 nt為單位的相變的siRNAs，即潛在的ta-siRNAs。利用Northen Blot技術(shù)在桑樹中檢測到了相關(guān)siRNAs的積累，進(jìn)而證明mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA級聯(lián)途徑的存在，表明Mu-Lnc1可能是桑樹中的一種新的TAS。
　　（2）Mul-MIR

4、3954基因的克隆及功能分析
　　利用PCR技術(shù)克隆得到了Mul-MIR3954基因，定量PCR分析發(fā)現(xiàn)mul-miR3954在桑樹根中的表達(dá)量最高，而在桑椹中的表達(dá)量最低，在不同組織或器官中表達(dá)量差異顯著。將Mul-MIR3954轉(zhuǎn)入擬南芥并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，通過Northern Blot和定量PCR分析發(fā)現(xiàn) Mul-MIR3954基因能在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達(dá)，加工產(chǎn)生 mul-miR3954成熟體。表型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Mul-MIR

5、3954在擬南芥中表達(dá)可以促進(jìn)植株根系生長。與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)基因植株對丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000）侵染、干旱和鹽分脅迫的敏感性增強。因此，Mul-MIR3954基因可能對植物的生長發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用，同時在植物對Pst DC3000侵染、干旱和鹽分脅迫的響應(yīng)過程中對植物的抗性起到負(fù)調(diào)控作用。
　?。?）MuLnc1基因的克隆及功能

6、分析
　　利用PCR技術(shù)克隆得到了MuLnc1基因，分析發(fā)現(xiàn)該基因在不同物種間保守性較差，在桑樹中該基因在桑椹中的表達(dá)量最高，而在樹皮中的表達(dá)量最低，在不同組織或器官中表達(dá)量也有明顯差異。將 MuLnc1基因轉(zhuǎn)入擬南芥并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，分析發(fā)現(xiàn)MuLnc1基因能在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達(dá)。表型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) MuLnc1在擬南芥中表達(dá)可以促進(jìn)植株生長，與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)基因植株對Pst DC3000侵染、干旱和鹽分脅迫的抗性增強。因此

7、，MuLnc1基因表達(dá)可能促進(jìn)植物的生長發(fā)育，同時增強植物對Pst DC3000侵染、干旱和鹽分脅迫的抗性。
　?。?）桑樹鈣調(diào)素類似蛋白基因CML27的克隆以及功能分析
　　利用PCR技術(shù)克隆得到了桑樹鈣調(diào)素類似蛋白基因CML27（命名為Mul-CML27），該基因編碼區(qū)全長為507 bp，編碼蛋白有168個氨基酸，理論分子質(zhì)量為18.5 kDa，等電點為4.38，是由無規(guī)則卷曲連接α螺旋折疊而成。該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和

8、信號肽，具有兩個鈣調(diào)蛋白共有的EFh超級家族結(jié)構(gòu)域和多個磷酸化位點。在桑樹中Mul-CML27基因在桑樹桑椹和根中的表達(dá)量較高，而在葉和樹皮中的表達(dá)量較低。將 Mul-CML27基因轉(zhuǎn)化擬南芥成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。相比野生型植株轉(zhuǎn)基因擬南芥株型較小，但根系較長，植株對Pst DC3000、干旱和鹽分脅迫具有較強的抗性。
　?。?）Mul-miR3954-MuLnc1-ta-siRNA級聯(lián)途徑功能分析
　　以轉(zhuǎn)MuLnc1基因

9、擬南芥為母本，轉(zhuǎn)Mul-MIR3954基因擬南芥為父本進(jìn)行雜交，獲得了F1雜交苗。通過Northern blot和定量PCR分析在雜交苗中檢測到Mul-MIR3954和MuLnc1基因的表達(dá)以及由mul-miR3954切割MuLnc1轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的次級siRNA si161579的積累，表在雜交苗中建立起了 Mul-miR3954-MuLnc1-ta-siRNA級聯(lián)途徑。雜交苗對Pst DC3000侵染、干旱和鹽分脅迫的抗性與野生型植株相