玉米大斑病菌HOg-MAPK級(jí)聯(lián)途徑中StHOG1基因的功能研究.pdf

1、本課題組前期克隆了玉米大斑病菌HOG-MAPK級(jí)聯(lián)途徑中的MAPK基因，并命名為StHOG1。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得2株StHOG1基因的敲除突變體;進(jìn)一步研究了該基因?qū)Σ【L(zhǎng)發(fā)育、致病力、高滲脅迫及殺真菌制劑敏感性的影響。研究結(jié)果不僅有助于闡明HOG-MAPK級(jí)聯(lián)途徑的功能，也為研發(fā)針對(duì)MAPK信號(hào)途徑的新型殺菌劑提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以pBS-PUC及pPZP100載體為骨架，構(gòu)建了玉米大

2、斑病菌StHOG1基因敲除載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，篩選得到2株草胺磷抗性轉(zhuǎn)化子;通過(guò)BAR基因引物PCR、StHOG1特異引物PCR、RT-PCR和Southern blotting證實(shí)這2株轉(zhuǎn)化子為StHOG1基因敲除突變體，分別命名為△StHOG1-1和△StHOG1-2。
　　(2)在PDA培養(yǎng)基中，玉米大斑病菌StHOG1基因敲除突變體菌落生長(zhǎng)速率顯著高于野生型菌株，突變體菌絲顏色較淺，氣生菌絲疏松，不產(chǎn)生分生孢子

3、，表明StHOG1基因負(fù)調(diào)控病菌的菌絲生長(zhǎng)，正調(diào)控分生孢子發(fā)育。
　　(3)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下，野生型菌株基生菌絲表面附著大量絮狀物質(zhì)而StHOG1基因敲除突變體基生菌絲表面光滑;在高滲脅迫培養(yǎng)基中，野生型菌株基生菌絲細(xì)胞壁表面的絮狀物質(zhì)變得致密，2株突變體菌絲細(xì)胞壁表面的致密絮狀物很少，說(shuō)明StHOG1基因與絮狀物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān);用細(xì)胞壁合成干擾物質(zhì)Congo red、CFW、SDS處理后，突變體菌落生長(zhǎng)抑制率

4、明顯低于野生型菌株，以上結(jié)果說(shuō)明StHOG1基因參與調(diào)控病菌細(xì)胞壁的發(fā)育。
　　(4)在0.4M NaCI、0.4M KCl、0.6M山梨醇的高滲脅迫條件下，突變體對(duì)高滲脅迫更敏感，菌落生長(zhǎng)受抑制程度高于野生型，尤其對(duì)山梨醇的反應(yīng);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)條件下兩株突變體與野生型菌株的甘油含量沒(méi)有明顯差異，而在高滲脅迫條件下野生型菌絲細(xì)胞的甘油含量約為突變體的1.5倍，這表明高滲脅迫下StHOG1基因缺失減少了病菌菌絲中甘油的積累