RNAi沉默Notch1、Notch2對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，高級別膠質(zhì)瘤的預(yù)后通常很差，因此，探討膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制，研究新的靶向治療手段就顯得十分重要。Notch信號是膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的新研究靶點(diǎn)。為深入了解Notch信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用，探討沉默Notch治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤這一可能的基因治療方法，本研究利用Notch1-shRNA慢病毒感染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，篩選獲得Notch1基因穩(wěn)定沉默的膠質(zhì)瘤細(xì)胞單克隆，對其體內(nèi)外增殖能力進(jìn)行研究，并采用基因表達(dá)譜芯

2、片技術(shù)，分析沉默Notch1對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的基因表達(dá)譜的影響。此外，本研究合成了Notch2的特異siRNA序列，并采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究Notch2基因沉默對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的體外增殖能力影響，以比較Notch1與Notch2在膠質(zhì)瘤中功能的異同點(diǎn)。
　　 第一部分采用實(shí)時(shí)定量PCR篩選有效的Notch2 siRNA序列，構(gòu)建Notch2-shRNA慢病毒載體，進(jìn)行病毒包裝，結(jié)果成功包裝出表達(dá)Notch2-s

3、hRNA和陰性對照shRNA的慢病毒，滴度分別為3.7×105TU/ml和2.5×105TU/ml。
　　 第二部分采用本實(shí)驗(yàn)室原有的Notch1-shRNA慢病毒和第一部分生產(chǎn)的Notch2-shRNA慢病毒感染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，篩選穩(wěn)定低表達(dá)Notch1和Notch2的細(xì)胞單克隆，實(shí)時(shí)定量PCR檢測Notch1和Notch2 mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測細(xì)胞Notch1和Notch2蛋白的表達(dá)；結(jié)果成功

4、篩選得到Notch1和Notch2穩(wěn)定沉默的U251細(xì)胞單克隆。
　　 第三部分采用CCK-8法測定細(xì)胞生長；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的集落形成能力；裸鼠種植瘤模型觀察Notch1沉默對種植瘤生長的影響。結(jié)果顯示Notch1穩(wěn)定沉默組的增殖與對照組相比明顯減慢；Notch1沉默組的平板克隆形成率為(18.6±2.5)％，低于對照組(37.0±3.3)％；Notch1沉默組軟瓊脂集落形成率(51±5)％，低于對

5、照組(80±4)％；Notch1沉默組裸鼠腋下種植瘤生長速度減慢，30天后瘤重(0.31±0.09)g，明顯低于對照組(2.35±0.71)g；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有顯著意義。而Notch2沉默對細(xì)胞增殖無影響。
　　 第四部分采用基因芯片技術(shù)，分析Notch1穩(wěn)定沉默對U251基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果顯示Notch1穩(wěn)定沉默細(xì)胞與對照細(xì)胞間的差異表達(dá)基因共有775個(gè)，涉及細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊與粘附、糖脂代謝、MAPK信號轉(zhuǎn)