IKKα在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、背景：
　　胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,胃癌引起的死亡位居全球腫瘤相關(guān)性死亡的第二位。嚴(yán)重威脅了我國人民的健康并且影響了人民的生活質(zhì)量。胃癌的發(fā)生受多種因素影響,其具體詳細(xì)機(jī)制還有待闡明。傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性的化學(xué)藥物對(duì)于轉(zhuǎn)移的胃癌的效力是有限的。目前許多涉及分子通路的研究都希望能以此作為胃癌治療的靶標(biāo)。在分子診斷方面的發(fā)展更加支持了新的分子靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。NF-kB是重要的轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控許多生物學(xué)過程,包括炎癥、細(xì)胞存活或者死亡、細(xì)

2、胞周期。它的異常激活通常能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生。IKKα是NF-kB通路必須的調(diào)控者,能夠通過改變核內(nèi)NF-kB調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)域繼而調(diào)控NF-kB下游基因的表達(dá)。研究證明IKKα能夠調(diào)控涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)展、血管生成等相關(guān)靶基因的表達(dá),因此它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著極為重要的作用。近年來IKKα在前列腺癌、乳腺癌中的作用已有報(bào)道,但是關(guān)于其在胃癌中的表達(dá)情況和作用未見報(bào)道。
　　目的：
　　1.探索IKKα在胃癌組織及其相

3、應(yīng)癌旁組織,原發(fā)胃癌組織和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織,高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞MKN28-M和低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞MKN28-NM中表達(dá)情況。
　　2.研究低表達(dá)IKKα對(duì)胃癌細(xì)胞體外遷移、侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.研究低表達(dá)IKKα對(duì)胃癌細(xì)胞增殖表型方面影響。
　　方法：
　　1.利用免疫組織化學(xué)的方法檢測IKKα在胃癌及癌旁,胃癌組織原發(fā)灶及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織組織芯片中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理資料之間的相關(guān)

4、性。利用Western blot實(shí)驗(yàn)方法及熒光定量PCR的方法在蛋白水平及 mRNA水平檢測高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞 MKN28-M及低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞MKN28-NM中IKKα的表達(dá)水平。
　　2.IKKα干擾慢病毒和對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染MKN28-M胃癌細(xì)胞系,構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)IKKα的MKN28-M細(xì)胞系,利用Western blot方法在蛋白水平驗(yàn)證其干擾效率,同時(shí)運(yùn)用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)在mRNA水平上驗(yàn)證IKKα干擾慢病毒的干擾效率。

5、r>　　3.利用體外劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察低表達(dá)IKKα后胃癌細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的改變。
　　4.利用裸鼠尾靜脈注射的方法檢測低表達(dá) IKKα后胃癌細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　5.利用MTT實(shí)驗(yàn)方法繪制低表達(dá)IKKα胃癌細(xì)胞的生長曲線,并利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)來觀察胃癌細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的成瘤能力的改變。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示:IKKα主要定位于細(xì)胞漿

6、,未見細(xì)胞核內(nèi)的染色。胃癌和癌旁組織芯片染色結(jié)果顯示,胃癌組織標(biāo)本陽性表達(dá)率為62％,癌旁組織標(biāo)本陽性表達(dá)率為24%。對(duì)胃癌組織原發(fā)灶及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)復(fù)合芯片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示:胃癌組織原發(fā)灶陽性率為32%。胃癌相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織陽性率為65%。將IKKα的表達(dá)水平與臨床患者病理學(xué)資料之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,IKKα的表達(dá)水平與患者性別、年齡無相關(guān)性,然而與腫瘤的侵潤深度(T,P<0.001)、淋巴結(jié)侵潤的數(shù)量(N,P

7、<0.001)、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M,P=0.001)密切相關(guān)。
　　2.Western blot及q RT-PCR結(jié)果顯示:IKKα在蛋白水平及mRNA水平上在高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系 MKN28-M中表達(dá)均高于低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28-NM。
　　3.Western blot及q RT-PCR結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染IKKα干擾慢病毒的MKN28-M細(xì)胞中 IKKα的表達(dá)無論是在蛋白水平還是在 mRNA水平均低于轉(zhuǎn)染對(duì)照慢病毒的MK

8、N28-M細(xì)胞。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:24小時(shí)進(jìn)行觀察顯示MKN28-M-shcontrol細(xì)胞已經(jīng)向?qū)γ姘l(fā)生遷移,兩側(cè)細(xì)胞間的間隙已經(jīng)基本發(fā)生融合。MKN28-M-shIKKα細(xì)胞24小時(shí)和0小時(shí)相比較,兩側(cè)細(xì)胞間的距離變化不大。
　　5.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:48小時(shí) MKN28-M-shcontrol細(xì)胞移至 Transwell小室微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)量明顯多于MKN28-M-shIKKα細(xì)胞。
　

9、　6.裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低表達(dá)IKKα的胃癌細(xì)胞產(chǎn)生肺臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯少于對(duì)照組,并且其形成的轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)大小亦小于對(duì)照組。
　　7.MTT生長曲線及平板克隆結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組低表達(dá) IKKα的胃癌細(xì)胞生長能力明顯低于對(duì)照組,平板克隆結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯高于實(shí)驗(yàn)組低表達(dá)IKKα的胃癌細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞克隆形成率為91.5%,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成率為58%,同時(shí)對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成的集落也大于實(shí)驗(yàn)組低表達(dá)IKKα的

10、胃癌細(xì)胞克隆形成的集落。
　　結(jié)論：
　　1.IKKα在胃癌中的表達(dá)水平顯著高于在癌旁組織中的表達(dá),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(47/75 vs18/75),IKKα在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平明顯高于胃癌組織原發(fā)灶(26/40 vs13/40),提示IKKα的表達(dá)水平與胃癌的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。IKKα的表達(dá)與患者性別、年齡無相關(guān)性,然而與腫瘤的侵潤深度(T,P<0.001)、淋巴結(jié)侵潤的數(shù)量(N,P<0.001)、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(