骨髓源性肝干細胞體外擴增后自體移植的臨床應用研究.pdf

1、目前對于晚期肝病(如肝硬化等)的最佳治療方法是肝臟移植,但是由于缺少供體以及排斥反應,使其在臨床上的應用受到限制。相比之下,干細胞移植不僅來源廣泛,創(chuàng)傷性小,而且干細胞的免疫源性低,其排斥反應遠遠低于肝臟移植。干細胞移植不但可以用于晚期肝病,也可以用于重癥肝病的治療,前景廣闊。骨髓細胞可以分化形成肝細胞的特定干細胞群,被稱之為骨髓源性肝干細胞(bone marrow derived liver stem cells BMDLSC),為肝

2、臟疾病治療提供了新思路和新手段。盡管肝干細胞的特征性表面標記至今沒有發(fā)現(xiàn),但Lagasse在酪氨酸小鼠研究中發(fā)現(xiàn)c-kit+Sca+Lin-細胞向肝細胞分化的能力比較強[1],而后唐等在放射性小鼠肝損傷修復更是進一步指出c-kit+Lin-(CD117)是一群富含BMDLSC的骨髓干細胞群[2],本小組前期研究已經(jīng)證實,骨髓中CD117陽性細胞和CD184陽性細胞都具有較強的肝干細胞潛能[3-5]。與其它類型的骨髓干細胞類似,c-kit

3、+Lin-細胞的數(shù)量有限,難以滿足未來應用的需要。
　　 本實驗利用非連續(xù)Percoll密度梯度離心對人自體骨髓進行分離,分離后的各界面層的細胞進行流式檢測CD117陽性細胞和CD184陽性細胞的比例,確定比例最高的細胞群后,從新鮮骨髓中獲取富含CD117陽性細胞和CD184陽性細胞的組分用于后實驗。然后將細胞在體外培養(yǎng)擴增0天、7天、14天,擴增方案采用含10％自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中和無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系

4、中加入不同濃度的促肝細胞生長素(HGPF)、促血小板生長素(TPO)和白細胞介素3(IL-3),分別培養(yǎng)摸索最佳培養(yǎng)基體系,經(jīng)最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)后用流式細胞計數(shù)法測定擴增細胞中CD117陽性細胞和CD184陽性細胞的數(shù)量變化,用實時定量PCR法檢測c-Met RNA表達的變化?？偨Y(jié)出人自體骨髓來源肝干細胞體外擴增后自體移植的技術(shù)方案,為將來臨床上進行骨髓來源肝干細胞體外擴增后自體移植治療肝臟疾病奠定基礎(chǔ)。
　　 [材料和方法]<

5、br>　　 1、密度梯度離心結(jié)合流式細胞術(shù)提取骨髓來源肝干細胞
　　 1.1 Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離骨髓細胞群
　　 從骨科手術(shù)回收成人骨髓2～5ml,使用percoll作為分離液,分成60％(1.077g/ml)、50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)、30％(1.043 g/ml)四個密度費聯(lián)系梯度,分離出4個有核細胞組分。
　　 1.2流式細胞儀檢測各個細胞組分中C

6、D117陽性細胞核CD184陽性細胞比例
　　 細胞計數(shù)后,取1×106個細胞置于1.5ml EP管中,離心調(diào)整為100μl體積,避光環(huán)境下,各管分別以PE標記抗人CD117直接抗體和APC標記抗人CD184直接抗體,細胞重懸至300μl上機檢測,分別記錄CD117陽性細胞核CD184陽性細胞比例。
　　 2、人骨髓源性肝干細胞體外擴增方案的探討
　　 2.1密度梯度離心結(jié)合流式細胞術(shù)分離富含CD117+細胞群<

7、br>　　 采集人體骨髓10～20ml,使用percoll作為分離液,分成50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)兩種濃度,過濾除菌后,由下至上按密度遞減置于離心管中,將預處理后的骨髓細胞懸液緩慢加至分層液上,400g離心力,離心25～30分鐘,可見各密度層間細胞層,留取CD117+細胞比例最高(Percoll濃度為50％與40％之間的細胞層)的細胞層為目的細胞群。
　　 2.2體外擴增富含CD117+人

8、自體骨髓來源肝干細胞
　　 2.2.1確定細胞培養(yǎng)密度
　　 骨髓細胞懸液,經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50％與40％之間層的細胞群,分別調(diào)整細胞濃度至6.25×105/ml、1.25×106/ml、2.50×106/ml、5.00×106/ml、1.00×107/ml、2.00×107/ml五組細胞濃度,于24孔板上培養(yǎng)14天,,培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(高糖,含10％自體血清,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲

9、肟),分別細胞計數(shù)分析。
　　 2.2.2確定細胞擴增最佳體系
　　 培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(高糖,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲肟),分別添加注射用促肝細胞生長素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml),注射用促血小板生長素(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml),白細胞介素3(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml),自體血清(10％、0％)

10、,共計128種組合。骨髓細胞懸液經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50％與40％之間層的細胞群,于24孔板上,隨機分成138份按確定的最佳細胞密度(細胞濃度為2.50×106/ml)分別加入到上述各培養(yǎng)基組合中,共計128孔,另外10份加入到隨機培養(yǎng)基組合中,作為計數(shù)對照孔,培養(yǎng)14天,根據(jù)生長情況傳代。分別記錄7天和14天細胞數(shù)量。
　　 2.3最佳體系擴增后檢測
　　 配置最佳培養(yǎng)體系:DMEM培養(yǎng)基(含10

11、％自體血清,40μg/mL注射用促肝細胞生長素,50ng/ml注射用TPO,10ng/ml白細胞介素3,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲肟)。
　　 2.3.1最佳擴增體系培養(yǎng)前后細胞表面CD117、CD184標記的變化 采集8例肝硬化患者骨髓,經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度50％N40％之間層的細胞群,于37℃、5％CO2孵育,每3～4天更換1/3量培養(yǎng)基,根據(jù)生長情況傳代,分別于培養(yǎng)前,培養(yǎng)第7天、第14天留取樣本,在

12、100ul環(huán)境中按1×106細胞加入20ul PE標記抗人CD117直接抗體以及20ul APC標記抗人CD184直接抗體孵育20分鐘,600g離心3分鐘,去上清,用1×PBS吹打勻細胞,600g離心力離心3分鐘,清洗3次,分別進行流式細胞儀檢測,觀察和計算最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)7天、14天后,細胞組分中CD117陽性細胞、CD184陽性細胞擴增倍數(shù)。
　　 3、人骨髓源性肝干細胞體外擴增后c-Met RNA表達的變化
　　

13、 3.1分組
　　 擴增0天(陰性對照)、擴增7天、擴增14天以及肝組織細胞(陽性對照)
　　 3.2引物設(shè)計合成
　　 GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物。設(shè)計引物所用軟件名稱:Primer express 2.0軟件,序列如下:Sequence Name:H-HGFR(擴增片段長度101bp)Forward Primer:5'-GCT GGA ACA CCC AGA TTG T

14、TT C-3’Reverse Primer:5’-CGA CAA CTA GAG CCA TGT TGA TG-3,Sequence Name:H-β-actin(擴增片段長度106bp)Forward Primer:5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’Reverse Primer:5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’
　　 細胞總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄反應(反應條件:37

15、℃ 1h,然后95℃ 3分鐘),熒光定量PCR反應(反應條件為:93℃ 3分鐘,然后93℃ 30秒,55℃ 45秒,72℃45秒,共40循環(huán))。
　　 3.3計算各細胞群HGFR/c-Met mRNA的表達水平與內(nèi)參基因H-β-actin比值
　　 反應結(jié)束后,由電腦自動分析并計算結(jié)果。結(jié)果拷貝數(shù),用B表示,即B=拷貝數(shù)/μl cDNA?？紤]到各個樣本總RNA濃度的差異,最終計算結(jié)果按下列公式換算:A=B1(目的基因)÷

16、B2(內(nèi)參基因),A則為HGFR/c-Met mRNA的表達水平與內(nèi)參基因H-β-actin比值。
　　 4.統(tǒng)計分析
　　 [結(jié)論]
　　 1)人骨髓有核細胞經(jīng)Percoll密度梯度離心后,位于40％與50％Percoll層之間的細胞群CD117陽性和CD184陽性的細胞比例最高。
　　 2)含10％自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加入HGPF 40μg/ml、TPO 50ng/ml、IL-310 n

17、g/ml是體外擴增骨髓源性肝干細胞的可行方案:按以上培養(yǎng)方案,7天時CD117陽性細胞和CD184陽性細胞的擴增倍數(shù)分別達到6.55倍和6.20倍,14天時CD184陽性細胞和CD117陽性細胞擴增倍數(shù)分別為11.62倍和20.57倍。臨床應用本方案擴增骨髓源性肝干細胞可以顯著減少抽取骨髓的需要量。
　　 3)BMDLSC細胞經(jīng)上述擴增方案擴增0天、7天、14天后,細胞的c-Met RNA表達水平表現(xiàn)為先上升后下降,分別為0.0