Hedgehog信號(hào)通路通過基質(zhì)金屬蛋白酶-7調(diào)節(jié)卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移.pdf

1、研究背景與目的:
　　卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率非常高的惡性腫瘤,在近三十年中死亡率并沒有呈下降趨勢。由于其發(fā)病隱匿,早期診斷相當(dāng)困難,一旦發(fā)現(xiàn)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Hedgehog(Hh)信號(hào)通路參與胚胎的發(fā)育及成人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持,在機(jī)體發(fā)育中扮演重要的角色。近年來研究顯示多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與Hh信號(hào)通路的異常激活有關(guān),包括卵巢癌。但Hh信號(hào)通路怎么參與調(diào)控卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞分子水平及動(dòng)物模型水平來初

2、步探討Hh信號(hào)通路參與卵巢癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及尋找卵巢癌的早期診斷治療靶點(diǎn),為卵巢癌新藥研發(fā)提供理論根據(jù)。
　　研究方法:
　　(1)根據(jù)NCBI查詢到的MMP7 cDNA序列在Invitrogen網(wǎng)站上設(shè)計(jì)3個(gè)靶向MMP7的干擾序列,連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,分別命名為miRMMP7-158、314、688。用脂質(zhì)體2000將MMP7干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人卵巢癌SKO-V3細(xì)胞,并用倒

3、置熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度以確定轉(zhuǎn)染效率。蛋白免疫印跡(Western blot)篩選有效的干擾片段。
　　(2)以優(yōu)化了的轉(zhuǎn)染條件【plasmid(ug):Lipofectamine2000(ul)=1:3】轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞SKO-V3,并通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力。
　　(3)分別用GANT61(Hh信號(hào)通路的抑制劑)與SHH信號(hào)通路配體條件培養(yǎng)液(Hh信號(hào)通路激活劑)處理人卵巢癌細(xì)

4、胞SKO-V3,然后通過real-TimePCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測MMP7 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　(4)用GANT61裸鼠皮下注射后檢測人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤組織中MMP7蛋白表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建干擾質(zhì)粒(miRMMP7-158、314、688),該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKO-V3細(xì)胞的熒光率大于80％。經(jīng)Western blot檢測MMP7蛋白表達(dá),其中MMP7-158為

5、最佳干擾質(zhì)粒(p<0.05)。
　　(2)轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組其侵襲與轉(zhuǎn)移能力均明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組(p<0.05);轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的SKO-V3細(xì)胞,加入SHH配體條件培養(yǎng)液組其侵襲與遷移能力明顯強(qiáng)于加入對照培養(yǎng)液組(p<0.05);轉(zhuǎn)染miRNAMMP7-158質(zhì)粒的SKO-V3細(xì)胞,加入SHH配體條件培養(yǎng)液組其侵襲與遷移能力與加入對照培養(yǎng)液組無差異(p>0.05)。
　　(3)經(jīng)SHH配體條件培養(yǎng)液刺激后,SKO-V

6、3細(xì)胞中MMP7的mRNA及蛋白水平的表達(dá)隨處理時(shí)間延長逐漸增高(p<0.05);而經(jīng)GANT61(20μM)處理后的SKO-V3細(xì)胞中MMP7的mRNA及蛋白表達(dá)水平隨處理時(shí)間延長逐漸降低(p<0.05)。
　　(4)免疫組化結(jié)果顯示,經(jīng)GANT61皮下裸鼠注射的人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤組織中,MMP7蛋白表達(dá)明顯低于對照組(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1. SHH配體條件培養(yǎng)液激活Hh信號(hào)通路,卵巢癌細(xì)胞的侵襲

7、與遷移能力明顯增強(qiáng),干擾MMP7表達(dá)后,能有效抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力,在干擾掉MMP7的SKO-V3細(xì)胞中無論是否激活Hh信號(hào)通路,卵巢癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力皆減弱,以上結(jié)果提示Hh信號(hào)通路很可能是通過MMP7的表達(dá)來調(diào)控卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　2.采用Gli特異性小分子抑制劑GANT61處理SKO-V3細(xì)胞后, MMP7的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降;用SHH配體條件培養(yǎng)液激活Hh信號(hào)通路后,卵巢癌細(xì)胞SKO-V3中MM