芯殼結(jié)構(gòu)電紡纖維攜載生物活性大分子的研究.pdf

1、電紡絲是一種使帶電荷聚合物溶液或熔體在靜電場中射流來制備聚合物超細纖維的技術(shù)，纖維直徑可控制在幾個納米到數(shù)十微米之間。電紡纖維由于具有高比表面積和類似于天然細胞外基質(zhì)的納米尺度結(jié)構(gòu)，在藥物釋放載體及組織工支架方面顯示出很大的應(yīng)用潛力。將攜載生物活性大分子的電紡纖維作為組織工程支架，在為細胞增殖和遷移提供支撐的同時，可通過釋放生物活性物質(zhì)調(diào)控細胞功能、促進細胞外基質(zhì)分泌以及加快組織再生。然而，由于多數(shù)生物活性物質(zhì)，例如生長因子和核酸等，并

2、不具有可紡性，同時穩(wěn)定性低，因此制備攜載生長因子和核酸的纖維支架就需要在制備及使用過程中有效保護其結(jié)構(gòu)與生物活性、調(diào)節(jié)其釋放行為。據(jù)此，本論文以乳液靜電紡絲技術(shù)制備具有芯殼結(jié)構(gòu)的載蛋白質(zhì)或基因纖維，研究蛋白質(zhì)或基因的釋放行為與纖維基質(zhì)材料組成以及其蛋白質(zhì)或基因在纖維中存在狀態(tài)之間的關(guān)系，以期得到可持續(xù)、可控并有效釋放蛋白質(zhì)或基因的纖維釋放體系。最后，將乳液電紡法制備的包裹堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和其表達質(zhì)粒(pbFGF)的電紡

3、纖維膜，應(yīng)用于大鼠糖尿病皮膚損傷的治療。
　　 以溶菌酶為模型蛋白，使用乳液靜電紡絲法制備了載蛋白質(zhì)的聚乳酸(PDLLA)纖維。經(jīng)掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡以及激光共聚焦微鏡觀察，纖維呈現(xiàn)芯殼結(jié)構(gòu)，溶菌酶被作為芯層包裹于聚合物纖維內(nèi)部。通過電泳、高效液相、紅外光譜、酶活檢測以及體外釋放實驗研究表明，芯殼纖維結(jié)構(gòu)可以抑制突釋，并且在釋放過程中保護溶菌酶的結(jié)構(gòu)完整性以及生物學活性。
　　 在載溶菌酶電紡纖維中，以提高包裹

4、效率、結(jié)構(gòu)完整性和生物活性保持率為目標，優(yōu)化了乳液電紡體系參數(shù)，如聚合物組成、水油相體積比與蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等，溶菌酶包裹效率達94.0％，酶比活力保持率為64.6％。載溶菌酶纖維在體外釋放過程中，釋放速率受纖維結(jié)構(gòu)塌陷加速釋放、與纖維粘連減少有效釋放面積減慢釋放的競爭性作用影響。以優(yōu)化參數(shù)制備的包裹量為0.46％的載溶菌酶聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA-10，PEG含量為10％)纖維，在體外釋放過程中的突釋量僅有近6％，且在約5周時

5、間內(nèi)持續(xù)釋放。
　　 根據(jù)糖尿病皮膚潰瘍治療時生長因子的用量要求，制備包裹量為0.079±0.015％。的載bFGF電紡纖維，體外釋放中突釋量為14.0±2.2％，在25天內(nèi)釋放持續(xù)。通過細胞增殖檢測、細胞伊紅染色、分泌膠原的天狼猩紅染色和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測，結(jié)果表明與浸潤自由bFGF的細胞培養(yǎng)板和空白纖維膜相比，載bFGF纖維對鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的粘附、增殖和Ⅰ型膠原分泌起到持續(xù)的促進作用。
　　 以綠色熒光

6、蛋白表達質(zhì)粒(pEGFP-N2)為模型，分別以裸質(zhì)?；蚺c陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)形成復(fù)合粒子的方式，通過乳液靜電法包裹于PELA-10纖維或PELA-10與PEI的共混纖維中。載質(zhì)粒或復(fù)合粒子的纖維具有芯殼結(jié)構(gòu)，電泳和細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，纖維的芯核結(jié)構(gòu)能夠保護質(zhì)?；驈?fù)合粒子不被降解。攜載裸pDNA電紡纖維由于缺乏轉(zhuǎn)染載體，不能對接種于纖維膜上的細胞進行有效轉(zhuǎn)染；以PEI和聚合物共混物作為纖維基質(zhì)材料攜載裸pDNA時，顯示出較高轉(zhuǎn)染

7、效率，但是對細胞的生長具有明顯的毒性；包裹PEI-pDNA復(fù)合粒子的電紡纖維釋放速率緩慢，但是可以有效轉(zhuǎn)染接種于纖維膜上細胞，并且對細胞的毒性較小。
　　 為調(diào)節(jié)攜載pDNA-PEI復(fù)合粒子電紡纖維中復(fù)合粒子的釋放行為，在纖維基質(zhì)材料中加入聚乙二醇(PEG)制備復(fù)合纖維。隨著PEG分子量和含量的增加，復(fù)合粒子的突釋量增加，持續(xù)釋放時間相應(yīng)減短，通過調(diào)節(jié)PEG的分子量和用量，釋放持續(xù)時間可控制在1周到1月的范圍內(nèi)。雖然加入聚合物纖

8、維的PEG改善了纖維的親疏水性，但纖維釋放的復(fù)合粒子轉(zhuǎn)染細胞對細胞的粘附與增殖都有影響。與未添加PEG電紡纖維的低轉(zhuǎn)染水平相比，含PEG電紡纖維能持續(xù)轉(zhuǎn)染細胞并表達綠色熒光蛋白。
　　 根據(jù)糖尿病皮膚潰瘍治療的時間要求，在優(yōu)化條件下制備了攜載pbFGF-PEI復(fù)合粒子的PELA和PEG復(fù)合纖維，復(fù)合粒子可以在4周內(nèi)持續(xù)釋放，接種于纖維膜上的MEF細胞持續(xù)表達bFGF。和浸潤pbFGF復(fù)合粒子的細胞培養(yǎng)板以及空白纖維膜相比，接種于

9、包裹復(fù)合粒子纖維膜上的細胞，其增殖受轉(zhuǎn)染引起的細胞毒性、bFGF表達引起的促進增殖的爭競性影響。
　　 在建立糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型的基礎(chǔ)上，將載bFGF電紡纖維、載pbFGF-PEI復(fù)合粒子電紡纖維分別覆蓋于糖尿病大鼠的皮膚缺損處時，研究對組織修復(fù)的促進作用。纖維膜在創(chuàng)傷愈合中主要起三方面作用：抑菌敷料、細胞生長支架以及生長因子或其質(zhì)粒的釋放載體。包裹bFGF的方式可以避免組織液中蛋白水解酶對生長因子的降解作用，而通過持續(xù)釋放

10、pbFGF-PEI復(fù)合粒子，可在創(chuàng)面持續(xù)表達bFGF。從新生微血管形成、細胞增殖、膠原分泌量及結(jié)構(gòu)、創(chuàng)面再上皮化速度、皮膚附屬器管生長等方面分別研究了皮膚修復(fù)過程，結(jié)果表明加快了創(chuàng)面各修復(fù)階段的進程，顯著縮短了創(chuàng)面愈合時間，新生上皮具有與正常皮膚類似的結(jié)構(gòu)特征。
　　 綜上所述，本論文首次系統(tǒng)地研究了以乳液靜電紡絲法構(gòu)建載蛋白質(zhì)或基因等生物活性大分子的芯殼結(jié)構(gòu)纖維，并成功應(yīng)用于糖尿病皮膚潰瘍的治療。通過對制備體系、釋放機制及與細