新型HBV反義RNA表達(dá)載體構(gòu)建、肝癌靶向轉(zhuǎn)移及抑癌效應(yīng)研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文新型HBV反義RNA表達(dá)載體構(gòu)建、肝癌靶向轉(zhuǎn)移及抑癌效應(yīng)研究姓名：馬春紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：孫汶生2002.4.24山東大學(xué)博士學(xué)位論文1、針對(duì)HBV關(guān)鍵區(qū)段反義RNA肝癌組織特異性表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增HBVpreS2(3203340)、preSl(23012925)和x(1370—1873)區(qū)段基因，克隆至質(zhì)粒型EB病毒載體pEBAFXbal位點(diǎn)，兩輪PCR篩選正、反向插入的重組子，測(cè)序鑒定

2、。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2215細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，NorthernBlot鑒定HBV反義RNA的表達(dá)，ELISA、熒光定量PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞中HBV抗原表達(dá)量和HBVDNA量。2、肝癌細(xì)胞靶向性反義RNA基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立21EGFR介導(dǎo)的四元復(fù)合體肝癌細(xì)胞靶向性基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立與靶向性鑒定利用腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的表皮生長因子受體EGFR，制備EGFR介導(dǎo)的四元復(fù)合體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，即設(shè)計(jì)針對(duì)EGFR的16肽GE7

3、作為配體寡肽(Ligandoiigopeptide，LOP)，合成流感病毒血凝素20寡肽Hk20作為內(nèi)吞小體釋放寡肽(Endosomereleasingoligopeptie，EROP)，同時(shí)合成多聚賴氨酸(polylysin，PL)為多聚陽離子多肽(Polycationicpolypeptide，PCP)，將EROP、LOP分別與PCP共價(jià)連接為多肽混合物。多肽混合物與質(zhì)粒DNA按l：1混合，制備EGFR介導(dǎo)的四元復(fù)合體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

4、體外培養(yǎng)EGFR陽性的HepG2215細(xì)胞和EGFR陰性的ECV304細(xì)胞，分別以脂質(zhì)體和四元復(fù)合體介導(dǎo)綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP—N1各1ug、02ug轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)。lX107HepG2215細(xì)胞懸液01m]腋窩皮下注射裸鼠，制備荷瘤動(dòng)物模型，分別行尾靜脈注射四元復(fù)合體包被的pEGFP—N1及脂質(zhì)體包被的pEGFP—N1，激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)。22雙重控制肝癌