內(nèi)皮細(xì)胞高表達脂多糖相關(guān)因子1(EOLA1)的亞細(xì)胞定位及在腫瘤組織中的表達研究.pdf

1、隨著人類基因組計劃(HGP)完成，明確人類30億個堿基對中包含了30000-40000個功能基因，這些基因的功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控多數(shù)尚不清楚。深入研究基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、功能和相互關(guān)系成為后基因組時代生命科學(xué)的主要任務(wù)。
　　EOLA1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor1)基因是我們實驗室在2002年通過抑制消減雜交(SSH)和cDNA末端擴增

2、技術(shù)(RACE)從脂多糖(LPS)刺激后的ECV304細(xì)胞中克隆到的一段全長cDNA序列，命名為內(nèi)皮高表達脂多糖相關(guān)因子1，作為人類新基因被GenBank全長序列庫所接收(No.AY074889)。目前,我們已完成對該基因的結(jié)構(gòu)及特性的基本研究，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄序列全長為1404個bp，定位于人染色體Xq28，跨越了6794bp的基因組序列，被4個內(nèi)含子分割為5個外顯子，在5′側(cè)翼區(qū)-734bp～-666bp存在核心啟動子，但無典型TATA盒

3、，其轉(zhuǎn)錄受到Sp1和Myf轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)由158個氨基酸組成，二級結(jié)構(gòu)含α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角，并形成一個螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋(HTH)基序，其氨基酸序列包含2個PKC磷酸化位點、1個酪氨酸激酶2磷酸化位點和1個氨基端糖基化位點，C-端含活化信號共整合子1類似物（activating signal cointegrator-1 homology，ASCH）功能域，因此，EOLA1屬ASCH超家族成員，分子量17.89k

4、Da，等電點6.43，親水性好，為可溶性蛋白。ASCH超家族遍布于各種生命體中，結(jié)構(gòu)上形成一個小β管狀結(jié)構(gòu)域，類似于PUA功能域，也能與RNA結(jié)合，推測在共激活、RNA加工和原核翻譯調(diào)控中發(fā)揮作用，介導(dǎo)了多種轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用和基本轉(zhuǎn)錄機制的進行。
　　Nortern blot顯示EOLA1基因在正常成人血管豐富的組織高表達，另外，在癌細(xì)胞株中EOLA1也有選擇性表達。迄今為止對EOLA1基因功能尚不清楚，但我們前期實驗已經(jīng)證實

5、EOLA1蛋白能與金屬硫蛋白2A（MT2A）相互作用，高表達EOLA1促進ECV304細(xì)胞增殖，抑制其表達后細(xì)胞生長明顯減慢，且肝移植炎癥反應(yīng)更加明顯。我們通過原核表達和家兔免疫已經(jīng)制備抗EOLA1多克隆抗體，擬在本課題中觀察EOLA1蛋白的亞細(xì)胞定位和腫瘤組織表達，以對EOLA1基因功能有更深入的了解。
　　為了完成亞細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了EOLA1-EGFP共表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞，瞬時表達后在激光共聚焦顯微鏡及免疫電鏡

6、下觀察綠色熒光定位。另外，我們采用免疫組化的方法檢測EOLA1蛋白在人體食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤和乳腺癌組織的表達。
　　在激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞漿及細(xì)胞核均有強綠色熒光信號，經(jīng)DAPI染色證實EGFP-EOLA1融合蛋白呈全細(xì)胞表達，有細(xì)胞核聚集現(xiàn)象。酶標(biāo)免疫電鏡也觀察到EOLA1蛋白在細(xì)胞漿的基質(zhì)中表達。EOLA1蛋白在檢測的食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤和乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞胞漿中都有表達，而在