5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇的抗腫瘤作用研究.pdf

1、在發(fā)展中國(guó)家，癌癥是僅次于心臟疾病的死亡率最高的疾病，隨著生存環(huán)境的惡化，人口增長(zhǎng)與老齡化，環(huán)境污染以及與癌癥有關(guān)的生活方式的改變（如吸煙、運(yùn)動(dòng)減少以及更多地采取西化飲食結(jié)構(gòu)），癌癥的發(fā)生率逐年增加。目前惡性腫瘤的治療方法包括手術(shù)、放療、化療和免疫治療等手段，以化學(xué)治療為主的綜合治療在其中占有十分重要的地位。化學(xué)治療指的是使用化學(xué)藥物殺滅腫瘤細(xì)胞，理想的化療藥物應(yīng)該是通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞毒作用，只針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性殺傷而不影響正常細(xì)胞

2、。但事實(shí)上，臨床常用的化療藥物其腫瘤抑制作用大多與劑量相關(guān)，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)具有細(xì)胞毒作用的無(wú)選擇性，從而對(duì)宿主全身會(huì)產(chǎn)生毒副作用，成為化療實(shí)施的障礙，從而在很大程度上影響腫瘤治療的效果。因此，除了尋找高效低毒的新化療藥物以外，還可以通過(guò)與其他化合物或藥物聯(lián)合產(chǎn)生相加或協(xié)同作用以提高化療效果。如能改變腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程，使大量腫瘤細(xì)胞暫時(shí)性蓄積在某一時(shí)相，同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞周期特異性藥物殺傷處于此藥物敏感時(shí)相的腫瘤細(xì)胞將能明顯提高治療效果

3、，同時(shí)也可降低化療藥物劑量從而減輕不良反應(yīng)，這樣的研究將具有重要意義。
　　 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)是常見(jiàn)的化療藥物，常用于實(shí)體瘤的治療，可以通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于G1/S期并干擾細(xì)胞基本生物合成過(guò)程誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。5-Fu還可以作為胸苷酸合成酶(TS)的抑制劑摻入DNA和RNA結(jié)構(gòu)中使腫瘤細(xì)胞無(wú)法正常合成DNA，影響其正常功能。鑒于5-Fu的作用機(jī)理，它在治療過(guò)程中也

4、會(huì)影響正常細(xì)胞的功能而產(chǎn)生毒副作用，另外，目前比較常見(jiàn)的5-Fu使用中產(chǎn)生的抗藥性也成了阻礙其發(fā)揮療效的障礙?，F(xiàn)在已有很多二線藥物如紫杉醇、絲裂霉素、四氫葉酸、喃氟啶等開(kāi)始與5-Fu聯(lián)合使用，其目的是在保持其抗腫瘤作用最大化的同時(shí)減少5-Fu的毒副作用。除了這些藥物以外，一些天然植物素也能達(dá)到對(duì)5-Fu增效減毒的效果。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種廣泛存在于自然界中的植物抗毒素，是植物對(duì)抗外界環(huán)境壓力如

5、氣候變化，暴露于更多的臭氧環(huán)境中，日曬和重金屬刺激以及病原微生物感染等情況時(shí)所產(chǎn)生的。大量研究結(jié)果顯示白藜蘆醇可以對(duì)抗多種疾病甚至癌癥。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)腫瘤的起始、促進(jìn)和發(fā)展三個(gè)階段均有抑制作用，可作為天然的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑。其抗腫瘤作用可能與其影響細(xì)胞生長(zhǎng)、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗侵襲能力有關(guān)。白藜蘆醇可以影響體內(nèi)多種基因表達(dá)，其中包括腫瘤抑制因子p53和Rb，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin家族以及多種凋亡調(diào)節(jié)因子。諸多的體內(nèi)外研究證實(shí)白

6、藜蘆醇可以作為抗腫瘤藥物或與其他化療藥物聯(lián)合使用治療一些有抗藥性的癌癥。
　　 皮膚癌尤其是非黑色素性皮癌(NMSC)是世界上發(fā)病數(shù)量最多的人類(lèi)腫瘤，近年來(lái)的發(fā)病率日益升高，據(jù)估計(jì)每年新增病例超過(guò)一百萬(wàn)。如此高的年發(fā)病率使其越發(fā)受到公眾的關(guān)注。食管癌的死亡率很高，在世界惡性腫瘤死亡率中占據(jù)第六位，而我國(guó)正是是食管癌的高發(fā)地區(qū)。鑒于這兩種腫瘤的高發(fā)性，本實(shí)驗(yàn)中選取食管鱗狀細(xì)胞癌株TE-1、人表皮癌A431細(xì)胞株作為研究對(duì)象來(lái)考察5

7、-Fu與白藜蘆醇聯(lián)合在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期和凋亡方面的作用，并對(duì)可能與聯(lián)合作用有關(guān)的凋亡通路進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)共分為四部分：
　　 第一部分5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞A431、TE-1生長(zhǎng)的抑制和細(xì)胞毒作用
　　 目的：研究5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞A431、TE-1生長(zhǎng)的抑制作用和致壞死能力
　　 方法：本部分實(shí)驗(yàn)中采用MTT法、生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)對(duì)5-Fu和白藜蘆醇的聯(lián)合用藥進(jìn)行評(píng)價(jià)，聯(lián)合用藥

8、的效果采用Chou-Talalay法進(jìn)行定量評(píng)價(jià)分析。細(xì)胞毒作用采用LDH溢出實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：(1)MTT實(shí)驗(yàn)顯示5-Fu有抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的能力，而且這種作用呈時(shí)間與濃度依賴性。而白藜蘆醇在較高濃度(不低于10μmol/L)才能夠產(chǎn)生抑制作用。二者聯(lián)合使用時(shí)在很大的濃度范圍內(nèi)都可以產(chǎn)生協(xié)同作用(白藜蘆醇不低于10μmol/L)。聯(lián)合用藥可以大大降低5-Fu或白藜蘆醇對(duì)A431的中效濃度(5-Fu的IC50從單獨(dú)使

9、用時(shí)的322.89μM降至71.99μM;白藜蘆醇的IC50從174.58μM降至37.56μM)。對(duì)TE-1聯(lián)合用藥可以分別將5-Fu的IC50從480.83μM降至151.87μM，而白藜蘆醇的IC50可從248.64μM降至69.42μM。該結(jié)果顯示5-Fu和白藜蘆醇聯(lián)合使用可在很大程度上減少各藥物的用量。
　　 采用Chou-Talalay法對(duì)5-Fu和白藜蘆醇的聯(lián)合作用48h的效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)兩藥聯(lián)合使用對(duì)腫瘤的的抑制

10、效應(yīng)達(dá)到50％時(shí)，A431細(xì)胞的聯(lián)合指數(shù)CI為0.438，而對(duì)TE-1的聯(lián)合指數(shù)CI為0.595。二者聯(lián)合在高于0.2的效應(yīng)范圍內(nèi)CI值均不高于1，說(shuō)明在一個(gè)很大的效應(yīng)范圍內(nèi)(0.2-0.95)5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇都能產(chǎn)生協(xié)同作用。(2)生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)5-Fu和白藜蘆醇單獨(dú)使用時(shí)都能對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用，當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線抑制更為明顯，與對(duì)照組和各單藥組相比均存在顯著性差異。(3)平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

11、14天后A431和TE-1各自有17.60％和26.75％的克隆形成率，白藜蘆醇單獨(dú)使用可以使兩種細(xì)胞的克隆形成率分別降至A4315.42％，TE-110.13％。而5-Fu單獨(dú)使用的克隆形成率分別為A4311.07％，TE-12.23％。兩種細(xì)胞的聯(lián)合用藥組則幾乎沒(méi)有克隆形成，各組間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)為極顯著性差異。(4)LDH活性實(shí)驗(yàn)顯示了5-Fu和白藜蘆醇單獨(dú)使用所導(dǎo)致的A431和TE-1細(xì)胞壞死分別出現(xiàn)在48h和72h后，而聯(lián)合給藥

12、組在24h即出現(xiàn)LDH的溢出，說(shuō)明聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用可能與壞死有一定關(guān)系，而且其程度均高于各單獨(dú)用藥組。
　　 結(jié)論：(1)5-Fu和白藜蘆醇都可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)間依賴和濃度依賴性抑制，聯(lián)合用藥組在大部分效應(yīng)范圍內(nèi)都表現(xiàn)為協(xié)同作用。(2)5-Fu和白藜蘆醇聯(lián)合或單獨(dú)使用都會(huì)對(duì)A431和TE-1的生長(zhǎng)曲線產(chǎn)生抑制作用，聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比存在顯著性差異。(3)細(xì)胞壞死在5-Fu單獨(dú)作用48h后參與到5-Fu對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑

13、制作用中來(lái)，而直到72h白藜蘆醇才會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的壞死，二者聯(lián)用則從24h即有細(xì)胞壞死現(xiàn)象的存在，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　 第二部分5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞A431、TE-1周期和增殖的影響
　　 目的：研究了5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)A431、TE-1細(xì)胞周期和周期增殖相關(guān)蛋白的影響。
　　 方法：采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)A431和TE-1的細(xì)胞周期進(jìn)行分析。Western blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白和增殖相關(guān)蛋白的表

14、達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)白藜蘆醇單獨(dú)作用24～72h均會(huì)引起A431和TE-1細(xì)胞的S期數(shù)量增多與相應(yīng)的G1期細(xì)胞數(shù)量減少，這種結(jié)果導(dǎo)致了A431和TE-1細(xì)胞的S期阻滯現(xiàn)象，與對(duì)照組相比，50μM白藜蘆醇對(duì)A431作用24h導(dǎo)致A431細(xì)胞的S-期比例從29.2±1.4％上升到65.3±2.5％(P＜0.01)。70μM白藜蘆醇對(duì)TE-1作用24h導(dǎo)致TE-1細(xì)胞的S期比例從26.2±3.2％增長(zhǎng)到89.3±3.7％（P＜0.

15、01)。5-Fu單獨(dú)用藥組和聯(lián)合給藥組都會(huì)引起A431和TE-1的G1期細(xì)胞的少量增加，但是這種增加在24h時(shí)與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，48h后才與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性差異，而且5-Fu組和聯(lián)合用藥組之間在不同時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有顯著性差異。(2)Western blot對(duì)周期蛋白的分析證實(shí)了流式的結(jié)果，白藜蘆醇導(dǎo)致的S期阻滯使CyclinD1和PCNA蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)減少。
　　 結(jié)論：(1)5-Fu單獨(dú)給藥或與白藜蘆醇聯(lián)合使用會(huì)使

16、A431和TE-1的細(xì)胞周期產(chǎn)生G0/G1期阻滯，白藜蘆醇單獨(dú)用藥會(huì)對(duì)A431和TE-1的細(xì)胞周期產(chǎn)生S期阻滯，鑒于5-Fu的抗腫瘤作用機(jī)制是與S期特異性殺傷有關(guān)，我們推測(cè)可能是白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞周期的影響（將腫瘤細(xì)胞大量阻滯于S期）使得A431和TE-1細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性增加，從而出現(xiàn)了協(xié)同作用。(2)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制可能是其抗癌作用的機(jī)制之一，CyclinD1和PCNA蛋白表達(dá)的下降也證實(shí)了這個(gè)假設(shè)。
　　 第三部分5-

17、氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)A431、TE-1細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：研究5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)A431和TE-1細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：采用了普通光鏡，DAPI染色和DNA片段化凝膠電泳分析等方法對(duì)藥物誘導(dǎo)A431和TE-1凋亡的現(xiàn)象進(jìn)行了觀察。使用AnnexinV-PI流式分析術(shù)對(duì)細(xì)胞的早期凋亡進(jìn)行分析。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化，western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，對(duì)5-Fu與白藜蘆醇聯(lián)合給藥的凋亡

18、機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 結(jié)果：(1)采用普通光鏡和DAPI染色法觀察了給藥后的A431和TE-1，觀察到A431和TE-1細(xì)胞都出現(xiàn)了膜不對(duì)稱性和細(xì)胞間連接的消失，以及細(xì)胞皺縮等現(xiàn)象。DAPI染色可以看到諸如核固縮，染色質(zhì)凝集等現(xiàn)象，并可觀測(cè)到凋亡小體。與單獨(dú)給藥組相比，聯(lián)合藥物組可以觀察到A431和TE-1細(xì)胞更多的形態(tài)學(xué)變化。5-Fu和白藜蘆醇作用48h后，光鏡下可以觀察到更多凋亡小體和典型的形態(tài)學(xué)變化。(2)給藥后產(chǎn)生凋亡的

19、情況也可以通過(guò)檢測(cè)DNA梯狀條帶的變化來(lái)進(jìn)行比較，DNA梯狀條帶的數(shù)量可以反映不同藥物的作用情況。5-Fu作用48h后，DNA斷裂不明顯，只有似有似無(wú)的現(xiàn)象出現(xiàn)，但是Res作用48h后，可以清晰地辨別出DNA的梯狀條帶(DNA Ladder)，在聯(lián)合藥物組作用48h后，DNA有序片段化更加明顯，條帶增多。(3)采用Annexin V-FITC和PI(propidium iodide)雙染的方法，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)給藥后A431和TE-1細(xì)

20、胞的早期凋亡現(xiàn)象。與對(duì)照組相比，5-Fu和白藜蘆醇單獨(dú)給藥組都出現(xiàn)了早期凋亡細(xì)胞比例的明顯增加（P＜0.05）。對(duì)照組A431細(xì)胞出現(xiàn)了少于6％的自發(fā)早期凋亡；而5-Fu(70μmol/L)或白藜蘆醇(50μmol/L)各自處理24h后分別誘發(fā)了A431細(xì)胞19％和9.3％的早期凋亡。二者同時(shí)給藥時(shí)，出現(xiàn)了凋亡率的大幅增加，約達(dá)到34.2％的早期凋亡率(與單藥組相比P＜0.01)。TE-1對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)了低于5％的自發(fā)凋亡，5-Fu(1

21、50μmol/L)或白藜蘆醇(70μmol/L)單獨(dú)作用24h可分別將TE-1的早期凋亡率提升到11％和7.5％．二者聯(lián)合給藥后TE-1的早期凋亡率增加到24.2％，與單獨(dú)給藥組相比有極顯著性差異（P＜0.01)。(4)鈣離子在細(xì)胞內(nèi)處于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游，其變化與凋亡的發(fā)生有關(guān)，5-Fu或白藜蘆醇單獨(dú)用均可使細(xì)胞中鈣離子的量增加，與單獨(dú)給藥相比，兩藥聯(lián)用使細(xì)胞中的鈣離子強(qiáng)度與有大量增加，與單獨(dú)給藥組呈極顯著性差異(P＜0.01)。為了

22、研究藥物聯(lián)合使用的機(jī)制是否與凋亡相關(guān)蛋白的改變有關(guān)，我們用western blot檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和PARP等的表達(dá)。結(jié)果顯示無(wú)論是5-Fu或白藜蘆醇都可以誘發(fā)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)水平的明顯下降，聯(lián)合藥物組的Bcl-2減少更為明顯。而凋亡促進(jìn)蛋白Bax和p53的表達(dá)水平卻隨著給藥出現(xiàn)大量增加。另外，聯(lián)合用藥組的凋亡促進(jìn)蛋白與凋亡抑制蛋白的比值(Bax/Bcl-2)與單獨(dú)給藥組相比大大增加。藥

23、物作用48h后細(xì)胞中caspase-3和PARP蛋白酶原的表達(dá)量減少，相應(yīng)活化的caspase-3和PARP片段的表達(dá)上調(diào)，與單獨(dú)給藥組相比，聯(lián)合用藥組表現(xiàn)出了更為明顯的下降和上調(diào)(P＜0.01)。以上結(jié)果提示5-Fu和白藜蘆醇聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同作用可能與上調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax和p53的表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。
　　 結(jié)論：(1)5-Fu和Res都可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞A431、TE-1發(fā)生不同程度的凋亡。(2)5-

24、Fu和Res聯(lián)合使用對(duì)腫瘤細(xì)胞A431、TE-1的凋亡有協(xié)同作用。(3)5-Fu和Res聯(lián)合使用對(duì)腫瘤細(xì)胞A431、TE-1凋亡作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡基因p53，Bax，下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)激活線粒體通路，從而活化caspase-3發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而活化底物PARP而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 第四部分5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠兩階段皮膚癌模型的抗腫瘤作用
　　 目的：研究了5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠兩階段皮

25、膚癌模型的抗腫瘤作用
　　 方法：小鼠皮膚乳頭狀瘤模型采用經(jīng)典的DMBA/TPA兩階段促癌法進(jìn)行誘發(fā)。western-blot檢測(cè)小鼠皮膚腫瘤中p53、Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)檢測(cè)鼠皮中活化caspase-3的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)給藥后皮膚中p53、Bax的表達(dá)水平上升，Bcl-2的表達(dá)水平下降，聯(lián)合給藥組組織中促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比值(Bax/Bcl-2)明顯增加。(2)5-Fu或白藜蘆醇單

26、獨(dú)給藥后均可引起小鼠表皮細(xì)胞中caspase-3的活化，聯(lián)合給藥組的活化程度與單獨(dú)給藥組相比有明顯的增加。
　　 結(jié)論：(1)與單藥相比，5-Fu和Res聯(lián)合給藥可以對(duì)小鼠表皮癌產(chǎn)生良好的治療效果，并減輕5-Fu對(duì)皮膚的強(qiáng)烈刺激。(2)5-Fu和Res聯(lián)合給藥可以通過(guò)調(diào)節(jié)p53、Bax和Bcl-2基因的表達(dá)以及上調(diào)Bax/Bcl-2的比例誘導(dǎo)小鼠表皮腫瘤產(chǎn)生凋亡。(3)5-Fu和Res聯(lián)合給藥還可以使小鼠表皮細(xì)胞中的凋亡執(zhí)行因子

27、caspase-3大量活化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。
　　 結(jié)論
　　 通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)研究可以得出以下結(jié)論：1、5-Fu和Res聯(lián)合給藥對(duì)人表皮癌A431和人食管鱗癌TE-1的生長(zhǎng)抑制有協(xié)同作用，而且呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性，與5-Fu和Res單獨(dú)用藥相比，可以更好的抑制A431和TE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和克隆形成，并在一定程度上通過(guò)增加A431和TE-1的壞死程度起到腫瘤抑制作用。2、Res可以影響A431和TE-1細(xì)胞的細(xì)胞

28、周期，將大量細(xì)胞阻滯在對(duì)5-Fu敏感的S期，同時(shí)降低PCNA的表達(dá)使細(xì)胞增殖減少，而5-Fu和Res聯(lián)合給藥也可將部分細(xì)胞阻滯在DNA合成前期從而減少腫瘤細(xì)胞的增殖。二者抗腫瘤的協(xié)同作用可能是上述原因綜合作用的結(jié)果。3、5-Fu和Res聯(lián)合給藥與單獨(dú)給藥相比能更大程度的影響與凋亡有關(guān)的生物轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Ca2+的胞內(nèi)表達(dá)和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（上調(diào)p53、Bax/Bcl-2比例，活化caspase-3，切割其特定底物PARP），產(chǎn)生更強(qiáng)程度的凋