四氫嘧啶類化合物L(fēng)H-2703抗炎免疫藥理作用的研究.pdf

1、目的:
　　 以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺為原料，合成四氫嘧啶類化合物L(fēng)H-2703，探討其抗炎鎮(zhèn)痛及免疫藥理作用。
　　 方法:
　　 1、以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺為原料，合成四氫嘧啶類化合物L(fēng)H-2703（1，3-二苯基-1,2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯），經(jīng)柱層析分離純化;
　　 2、取昆明種小鼠50只，隨機(jī)均分為5組，分別為溶媒對(duì)照組，阿司匹林陽(yáng)性藥物組(200mg/kg.b.w

2、)及化合物L(fēng)H-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。采用二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹模型每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天。末次給藥后1h，在每只小鼠右耳上均勻涂布二甲苯40μl（耳廓內(nèi)外兩側(cè)各20μl）致炎，30min后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓線剪下左、右耳片，用內(nèi)徑為8mm的打孔器分別在左、右耳相同位置打下耳片，稱重，計(jì)算耳廓腫脹度;
　　 3、取SD大鼠40只，

3、隨機(jī)均分為5組，分別為溶媒對(duì)照組，阿司匹林陽(yáng)性藥物組(200mg/kg.b.w)及化合物L(fēng)H-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天。末次給藥后60min，從大鼠右后足趾向遠(yuǎn)心端方向皮下注射高壓滅菌的1％角叉菜膠生理鹽水液0.1ml/只大鼠，并用記號(hào)筆在踝關(guān)節(jié)處做好標(biāo)記，用大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x分別在注射1％角叉菜膠生理鹽水液，1、2、3、4及

4、5h時(shí)刻測(cè)定大鼠右后足容積。計(jì)算大鼠足趾腫脹度;
　　 4、取昆明種小鼠60只，隨機(jī)均分為5組，分別為溶媒對(duì)照組，阿司匹林陽(yáng)性藥物組(200mg/kg.b.w)及化合物L(fēng)H-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。灌胃給藥，單次給藥后60min，按0.1ml/10g.b.w腹腔注射新配制的0.7％醋酸生理鹽水液。觀察并記錄注射0.7％醋酸生理鹽水液后20min

5、內(nèi)小鼠扭體次數(shù);
　　 5、取健康昆明種小鼠50只，實(shí)驗(yàn)前將鼠尾進(jìn)入（50±0.5）℃恒溫水浴鍋，記錄甩尾反應(yīng)潛伏期為痛閾。預(yù)選痛閾5-30s者為合格鼠。隨機(jī)均分為5組，分別為溶媒對(duì)照組，鹽酸曲馬多陽(yáng)性藥物組(10mg/kg.b.w)及化合物L(fēng)H-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。單次灌胃給藥，于給藥后0.5h時(shí)測(cè)定小鼠痛閾值;
　　 6、取昆明

6、種小鼠50只，體重（20±2）g，雌性，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)55℃熱板篩選剔除痛閾值大于30s或小于5s的動(dòng)物，隨均分為5組，分別為溶媒對(duì)照組，曲馬多陽(yáng)性藥物組(10mg/kg.b.w)及化合物L(fēng)H-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。灌胃給藥1次。于給藥后0.5h測(cè)定痛閾，以小鼠足部接觸熱板到開(kāi)始舔后足的時(shí)間為痛閾值。觀察并記錄痛閾;
　　 7、采用Griess試劑

7、盒觀察其對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)的影響;ELISIA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-1(IL-1β)含量;
　　 8、MTT法檢測(cè)正常小鼠脾細(xì)胞的代謝活力;
　　 9、采用小鼠碳粒廓清、溶血素及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)模型分別觀察其對(duì)正常小鼠非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫的影響。
　　 結(jié)果:
　　 合成了四氫嘧啶類化合物L(fēng)H-2703（1，3-二苯基-1,2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯），經(jīng)硅膠柱層

8、析分離純化，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、1H-NMR和13C-NMR確證。化合物L(fēng)H-2703在高、中、低劑量(200、100、50mg/kg.b.w)均能顯著抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹，平均耳廓腫脹抑制率分別為53.1％、46.3％、26.6％，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.001，P=0.013);測(cè)量時(shí)間為3h時(shí)，化合物L(fēng)H-2703在高、中劑量時(shí)(200、100mg/kg.b.w)對(duì)大鼠足趾腫脹均有顯著抑制，平均抑制

9、率分別為46.4％、33.9％，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P=0.007);化合物L(fēng)H-2703高、中、低劑量(200、100、50mg/kg.b.w)均能顯著減少正常小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，平均扭體反應(yīng)抑制率分別為51.3％、40.8％、25.1％，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P=0.002，P=0.047);化合物L(fēng)H-2703高劑量組(200mg/kg.b.w)對(duì)小鼠熱水浴甩尾反應(yīng)潛伏期能顯著延長(zhǎng)，

10、痛閾提高百分率為36.4％，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044);LH-2703高、中劑量組(200、100mg/kg.b.w)對(duì)小鼠熱板法的痛閾時(shí)間顯著延長(zhǎng)，痛閾提高百分率分別為48.0％、23.7％，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P=0.006);化合物L(fēng)H-2703高濃度組(20μg/ml)對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和IL-1β都有不同程度的抑制作用，抑制率分別為26.8％、29.9％，與LPS對(duì)照組比較有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義(P=0.036，P=0.009);化合物L(fēng)H-2703對(duì)正常小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫，均沒(méi)有顯著作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺為原料，經(jīng)氨基化作用、Mannich反應(yīng)、親核加成反應(yīng)和脫氨基環(huán)化等多組分反應(yīng)合成了四氫嘧啶類化合物L(fēng)H-2703，方法具有操作簡(jiǎn)單，原料易得，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)收率高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 2、反應(yīng)粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚:乙酸乙酯(V∶

12、V=1:7～1:5)為流動(dòng)相分離純化，方法操作簡(jiǎn)單、易行。
　　 3、化合物L(fēng)H-2703對(duì)二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹度均有良好的抑制作用，提示其具有良好的抗炎作用。
　　 4、化合物L(fēng)H-2703可以顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù)和延長(zhǎng)扭體潛伏期，并有一定的劑量依賴關(guān)系，提示其具有良好的外周鎮(zhèn)痛活性。
　　 5、化合物L(fēng)H-2703在200mg/kg.b.w劑量時(shí)可以顯著延長(zhǎng)熱水浴甩尾及

13、熱板法的痛閾值，提示其具有良好的中樞鎮(zhèn)痛活性。
　　 6、化合物L(fēng)H-2703可以顯著抑制巨噬細(xì)胞NO和IL-1β的分泌，且有一定的劑量依賴性，提示其具有良好的抑制炎癥因子的作用。
　　 7、化合物L(fēng)H-2703對(duì)正常小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫，均沒(méi)有顯著作用，提示其對(duì)體內(nèi)免疫系統(tǒng)無(wú)顯著影響。
　　 8、化合物L(fēng)H-2703對(duì)小鼠正常脾細(xì)胞代謝活力有一定的抑制作用，提示其對(duì)體外免疫細(xì)胞有一定調(diào)節(jié)作用。