廣西不同產(chǎn)地何首烏DNA、HPLC指紋圖譜研究.pdf

1、目的：
　　1.建立何首烏ISSR–PCR的實(shí)驗(yàn)體系及鑒別方法，探討廣西不同產(chǎn)地何首烏親緣關(guān)系，并對(duì)不同產(chǎn)地何首烏進(jìn)行遺傳多樣性分析，為廣西產(chǎn)何首烏優(yōu)質(zhì)種源的開發(fā)提供質(zhì)量依據(jù)；
　　2.探討廣西不同產(chǎn)地何首烏的質(zhì)量狀況，并對(duì)其相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為廣西不同產(chǎn)地何首烏的鑒別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)廣西不同產(chǎn)地何首烏進(jìn)行分子生藥學(xué)研究，篩選最佳的總 DNA提取方法，通過 I

2、SSR–PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出特異性擴(kuò)增引物，鑒別廣西不同產(chǎn)地何首烏，建立DNA指紋圖譜。此外，還應(yīng)用相關(guān)分析軟件MVSP3.2和Popgene32對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析和遺傳多樣性分析。
　　2.通過高效液相色譜法建立何首烏指紋圖譜，為完善廣西何首烏質(zhì)量體系提供依據(jù)。摸索并確定合適的色譜分離條件，選擇穩(wěn)定性好、色譜峰豐富的提取方法對(duì)樣品進(jìn)行提取，并進(jìn)行相關(guān)方法學(xué)考察，對(duì)廣西不同產(chǎn)地何首烏進(jìn)行對(duì)比分

3、析，使用“計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)10批何首烏藥材進(jìn)行相似度比較分析。
　　結(jié)果:
　　1.何首烏總DNA提取方法：CTAB法。
　　2.何首烏ISSR–PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：25μl反應(yīng)體系包括1×Taq酶配套緩沖液，1.8m mol·L–1MgCl2，200μmol·L–1dNTP，0.2μmol·L–1引物，1UTaq DNA聚合酶，DNA模板約50 ng。相應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4℃預(yù)變性5mi

4、n；②94℃變性30s；③50℃退火1min；④72℃延伸2min；⑤2～4步驟循環(huán)45次；⑥72℃延伸10min。
　　3.何首烏的DNA指紋圖譜研究：選用40條ISSR擴(kuò)增引物，從中篩選出9條穩(wěn)定性好、譜帶清晰的引物。通過擴(kuò)增共獲得清晰的條帶117條，其中多態(tài)性條帶111條，擴(kuò)增片段的多態(tài)性達(dá)到94.87％。其中，引物UBC–840能清晰穩(wěn)定地區(qū)分桂平、田林、桂林、賀州四個(gè)產(chǎn)地的何首烏，可作為鑒別何首烏的特異性引物，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)地間

5、鑒別。此外，引物UBC–815、UBC–845、UBC–852可鑒別出田林、桂林兩個(gè)產(chǎn)地何首烏；引物UBC–835、UBC–876可鑒別出桂平、桂林兩個(gè)產(chǎn)地何首烏，引物UBC–818可鑒別出田林、賀州兩個(gè)產(chǎn)地何首烏。通過UPGMA聚類分析中相似度可知，何首烏根據(jù)ISSR標(biāo)記劃分的類型同地理分布有一定關(guān)系，地理位臵較近的樣品多聚在一起。Shannon多樣性指數(shù)和Nei遺傳多樣性指數(shù)都一致地表明田林、賀州這兩個(gè)種源的遺傳多樣性要比何首烏種源

6、遺傳多樣性的平均水平高，另外兩個(gè)何首烏種源的多態(tài)性則低于何首烏種源多態(tài)性的平均水平。ISSR是鑒別廣西不同產(chǎn)地何首烏的有效方法。
　　4.何首烏的HPLC指紋圖譜的研究：樣品提取方法，以甲醇超聲處理30 min為佳,其峰信息較多,保留時(shí)間有較好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。色譜條件以安捷倫Agilent TC–C18(5μm,4.6 mm×250mm)，乙腈–水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8ml·min–1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280n

7、m，進(jìn)樣量10μl。本研究參照峰為何首烏中重要的活性成分二苯乙烯苷。經(jīng)方法學(xué)考察表明，建立的實(shí)驗(yàn)方法切實(shí)可靠，符合建立指紋圖譜的相關(guān)規(guī)定。借助中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，共匹配得到6個(gè)共有物質(zhì)峰。得到10批何首烏藥材的指紋圖譜，并生成對(duì)照?qǐng)D譜。運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，計(jì)算各批藥材間的相似度和各批藥材與對(duì)照指紋圖譜間的相似度。
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)廣西不同產(chǎn)地何首烏進(jìn)行IS

8、SR鑒別研究，建立了最佳實(shí)驗(yàn)體系；篩選出9條穩(wěn)定性好、譜帶清晰的引物，并得到了用于鑒別的特異性引物 UBC–840；運(yùn)用軟件 MVSP3.2和Popgene32對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，證實(shí)廣西不同產(chǎn)地何首烏遺傳關(guān)系的差別并進(jìn)行了遺傳多樣性分析；探討了ISSR作為何首烏分子生藥學(xué)鑒別有效方法的實(shí)驗(yàn)過程，方法可行。
　　2. HPLC–FPS實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出廣西不同產(chǎn)地何首烏中各種成分的差異，為何首烏藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為進(jìn)一步制定