食源性致病菌阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌LAMP快速檢測技術(shù)的建立與初步應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、一、研究背景和目的:
   近年來,隨著經(jīng)濟全球化進程的加快,食品安全已成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因,對人類健康造成極大危害,是食品安全的重大隱患。隨著經(jīng)濟發(fā)展和技術(shù)進步,食源性疾病并未減少或消失,世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件反而接連發(fā)生,食品安全形勢嚴峻。目前,食源性致病菌的檢測存在特異性差、操作繁瑣、耗時,以及不能現(xiàn)場應(yīng)用等問題。本研究旨在建立阪崎腸桿菌(EnterobacterSakaz

2、akii)和痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)兩種常見食源性致病菌的快速檢測方法。
   阪崎腸桿菌是一種重要的食源性致病菌,呈世界性分布,主要通過嬰幼兒配方奶粉經(jīng)消化道感染兒童,引起新生兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎,甚或遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥或?qū)е滤劳?。目前,引起阪崎腸桿菌感染事件的發(fā)生規(guī)模呈明顯上升趨勢,已成為我國重要的食源性致病菌。國際食品微生物標準委員會于2002年將阪崎腸桿菌列為對特定人群產(chǎn)生嚴重的生命

3、危害或產(chǎn)生慢性后遺癥的微生物。國家質(zhì)檢總局于2005年8月頒布了檢測阪崎腸桿菌的行業(yè)標準SN/T1632.1。2006年,針對嬰幼兒配方乳粉受阪崎腸桿菌污染的高風(fēng)險性和污染后的巨大危害性,國家質(zhì)檢總局頒布了嬰幼兒配方乳粉中阪崎腸桿菌每批必檢的市場準入要求。檢測阪崎腸桿菌的傳統(tǒng)方法步驟繁瑣,一般須耗時6d左右,近年來國內(nèi)外相繼建立了ELISA、PCR、核酸雜交等檢測技術(shù)。
   痢疾志賀菌是人和動物腸道內(nèi)寄生的革蘭陰性無芽胞桿菌,

4、是一類具有較強傳染性、危害嚴重的革蘭陰性腸道致病菌,所致的細菌性痢疾(Shigellosis)是世界上尤其是發(fā)展中國家重要的傳染病之一,全球每年細菌性痢疾病例高達1.65億,其中1.63億發(fā)生在發(fā)展中國家,并導(dǎo)致110萬患者死亡,其中60%以上為5歲以下兒童。近年來,痢疾志賀菌食物中毒的發(fā)生規(guī)模呈明顯上升趨勢,成為我國首要的食源性致病菌之一。目前,我國常用的志賀氏菌的檢驗方法主要是國標法(GB/T4789.5-2003)。整個檢測程序需

5、要3~5d完成,檢測時間長,檢出限為104CFU/mL。免疫學(xué)方法簡單,但靈敏度不高;PCR方法具有靈敏、快速等優(yōu)點,但檢測成本較高,儀器昂貴,不適于基層單位推廣應(yīng)用。
   綜上,建立準確、靈敏、操作簡便、不依賴昂貴儀器的檢測方法對于食源性致病菌感染的診斷、疾病控制和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義;發(fā)展快速準確、操作簡便的檢測與鑒定阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌的方法成為相關(guān)研究的熱點。目前,常用快速檢測方法主要有ELISA、DNA探針、常

6、規(guī)PCR、Real-timePCR等。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一種新穎的核酸擴增技術(shù),依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下高效擴增核酸,具有高特異性、快速、靈敏、操作簡便等特點。自從2000年以來,LAMP技術(shù)在臨床疾病的診斷、病原性細菌或病毒的定性檢測以及動物胚胎性別鑒定等方面應(yīng)用廣泛。LAMP技

7、術(shù)在國內(nèi)起步較晚,應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌在國內(nèi)外文獻中報道較少。
   本研究針對阪崎腸桿菌外膜蛋白OmpA基因和痢疾志賀菌ipaH基因,分別設(shè)計相應(yīng)的LAMP引物,建立優(yōu)化的反應(yīng)體系,考察特異性和靈敏度,并應(yīng)用于食品樣品的直接檢測,初步建立阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌的LAMP檢測方法。
   二、研究方法:
   1.阪崎腸桿菌LAMP快速檢測技術(shù)的建立與初步應(yīng)用
   (1)阪崎腸桿菌

8、LAMP檢測技術(shù)的建立
   根據(jù)GenBank公布的阪崎腸桿菌外膜蛋白OmpA基因序列(Accessionnumber:DQ000206)的保守區(qū),利用LAMP專用軟件PrimerExplorerversion4設(shè)計一套特異性引物,即外引物F3和B3、內(nèi)引物BIP和FIP,以阪崎腸桿菌(ATCC29544)提取的DNA為模板,建立檢測阪崎腸桿菌的LAMP檢測技術(shù)體系,并對反應(yīng)體系內(nèi)各反應(yīng)條件進行優(yōu)化,最終摸索出優(yōu)化后檢測阪崎腸

9、桿菌的LAMP反應(yīng)體系。
   (2)阪崎腸桿菌LAMP靈敏度、特異性實驗和實際樣品檢測
   利用建立的LAMP方法檢測阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物,考察其靈敏度。將過夜培養(yǎng)的阪崎腸桿菌(ATCC29544)菌液10倍倍比稀釋至10-1~10-8,取各稀釋度菌液100ul進行平板計數(shù)。同時取各稀釋度菌液1ml提取DNA,取2ul上清液作為模板進行LAMP擴增和PCR擴增,測試兩種方法檢測阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度。
  

10、 選取3株阪崎腸桿菌標準菌株和大腸埃希菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌等12株其它非阪崎腸桿菌致病菌進行特異性實驗,檢測LAMP方法的特異性。依據(jù)本實驗所建立的LAMP和PCR的條件和參數(shù),對36份奶粉樣品進行檢測,并與FDA檢測方法進行比較。
   2.痢疾志賀菌LAMP快速檢測技術(shù)的建立與初步應(yīng)用
   (1)痢疾志賀菌LAMP檢測技術(shù)的建立
   根據(jù)GenBank公布的痢疾志賀菌ipaH基因序列(Acces

11、sionnumber:M76445)中的保守區(qū)作為靶序列,設(shè)計痢疾志賀菌特異性引物,包括外引物F3和B3、內(nèi)引物BIP和FIP、環(huán)引物L(fēng)F和LB。以痢疾志賀菌(CMCC48097)提取的DNA為模板,建立檢測痢疾志賀菌的LAMP檢測技術(shù),并對反應(yīng)體系內(nèi)各反應(yīng)條件進行優(yōu)化。最終得出優(yōu)化后檢測痢疾志賀菌的LAMP反應(yīng)體系。
   (2)痢疾志賀菌靈敏度、特異性實驗和實際樣品檢測
   采用建立的LAMP方法檢測痢疾志賀菌純培

12、養(yǎng)液,考察其靈敏度。將過夜培養(yǎng)的痢疾志賀菌(CMCC48097)菌液10倍倍比稀釋至10-1~10-8,取各稀釋度菌液100ul進行平板計數(shù)。同時取各稀釋度菌液1ml提取DNA,取2μl上清液作為模板進行LAMP擴增和PCR擴增,測試兩種方法檢測痢疾志賀菌純培養(yǎng)物靈敏度。
   同時選取4株志賀菌標準菌株和大腸埃希菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌等其它非志賀菌進行特異性實驗,檢測LAMP方法的特異性,初步應(yīng)用于人工污染豬肉樣品痢疾

13、志賀菌的檢測,并與常規(guī)PCR方法比較。
   三、結(jié)果:
   1.確定阪崎腸桿菌LAMP優(yōu)化反應(yīng)體系為:6mMMgCl2,0.6mMdNTPs,0.8Mbetaine,0.4μM外引物(F3和B3),1.6μM內(nèi)引物(FIP和BIP),8U的BstDNA聚合酶,2.5μlThermopolbuffer,2μLDNA模板,ddH2O補足體積至25μl;擴增溫度58℃,反應(yīng)60min,產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析,得到典型

14、的LAMP梯形條帶,肉眼觀察反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀。
   LAMP法能檢出所有的阪崎腸桿菌菌株,產(chǎn)生特異性擴增的梯形條帶,直接用肉眼觀察到焦磷酸鎂白色沉淀,而其它腸道致病菌均未產(chǎn)生特異擴增的梯形條帶。LAMP對阪崎腸桿菌純菌液檢測靈敏度為2.0×101cfu/mL,PCR檢測靈敏度為2.0×102cfu/mL;LAMP檢測的靈敏度是傳統(tǒng)PCR靈敏度的10倍,檢測時間縮短了2~3h。采用LAMP法檢測36份奶粉樣品,其中2份

15、樣品檢出阪崎腸桿菌,陽性率為5.6%,與FDA方法檢測結(jié)果一致。
   2.確定痢疾志賀菌的LAMP反應(yīng)體系為:5mMMgCl2,0.3mMdNTPs,0.6Mbetaine,0.4μM外引物(F3和B3),1.6μ.M內(nèi)引物(FIP和BIP)與1.6μM環(huán)引物(LF和LB),8UBstDNA聚合酶大片段,ThermoPolbuffer2.5μl,DNA模板2μl,ddH2O補足體積至25μl;擴增溫度63℃反應(yīng)60min,產(chǎn)物

16、于2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,得到典型的LAMP梯形條帶。
   LAMP法能檢出4株志賀菌,產(chǎn)生特異擴增的梯形條帶,其余腸道致病菌均未產(chǎn)生特異擴增的梯形條帶,表明選用的志賀菌ipaH基因引物的特異性強。LAMP法對痢疾志賀菌純菌液檢測靈敏度為5.3×101cfu/ml,對人工污染的豬肉樣品的痢疾志賀菌檢測限為6.8×101cfu/ml。PCR檢測的靈敏度為5.3×102cfu/ml,豬肉樣品為6.8×102cfu/mL,LAM

17、P的靈敏度均比傳統(tǒng)PCR靈敏度高10倍,整個檢測過程可在2h內(nèi)完成。
   四、結(jié)論:
   本研究建立了乳制品中阪崎腸桿菌、肉制品中痢疾志賀菌的LAMP快速檢測技術(shù),并在實際樣品檢測中得到了初步應(yīng)用。LAMP檢測技術(shù)針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條(6條)特異引物,特異性強;LAMP檢測限為101cfu/mL,是PCR法靈敏度的10倍。LAMP法能直接對奶粉、肉制品、乳制品等食品中的致病菌進行檢測,實際樣品一般在20~28

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