阪崎腸桿菌免疫磁性富集及快速檢測方法研究.pdf

1、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是近年乳制品中新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌，已被世界衛(wèi)生組織和許多國家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，死亡率高達(dá)50％。建立阪崎腸桿菌快速而特異性的富集和檢測方法，是有效控制和預(yù)防食品中阪崎腸桿菌污染的關(guān)鍵所在。本研究基于免疫技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，制備了阪崎腸桿菌免疫磁性微球和免疫熒光探針。主要通過免疫磁性微球富集和免疫熒光探針標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)阪崎腸桿菌的高靈敏度、快速檢測，以

2、克服傳統(tǒng)檢測技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)及單一免疫檢測技術(shù)存在的缺陷。為免疫技術(shù)在致病性微生物檢測領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供有力的科學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　(1)建立了一種快速高效制備阪崎腸桿菌多克隆抗體的方法。采用皮下多點(diǎn)注射與耳緣靜脈注射相結(jié)合的短程免疫方法用阪崎腸桿菌顆粒性抗原免疫新西蘭大白兔，抗血清在免疫19天后即可獲得，純化后的效價高達(dá)1∶20480，完全滿足免疫檢測的需求。特異性研究結(jié)果表明所制備的多克隆抗體對阪崎

3、腸桿菌有高度的特異識別性，與近緣菌株大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌無交叉反應(yīng)。并首次鑒定了阪崎腸桿菌的顆粒性抗原蛋白為丙酮酸脫氫酶E1和分子伴侶蛋白GroEL。本研究制備多克隆抗體的方法新穎、簡單且高效。
　　(2)以殼聚糖和納米四氧化三鐵為原料，采用反向懸浮交聯(lián)法制備了磁性殼聚糖微球，并對其進(jìn)行了表征。結(jié)果表明磁性殼聚糖微球呈均一的球狀，粒度均勻;具有很好的磁響應(yīng)性、超順磁性及熱穩(wěn)定性。表面光滑、致密，無孔，在后期的利用過程中

4、可以減少非特異性吸附。
　　(3)對磁性殼聚糖微球的表面用氯乙酸進(jìn)行羧基改性，制備了表面羧基化磁性殼聚糖微球。然后利用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)將表面羧基化磁性殼聚糖微球和阪崎腸桿菌的多克隆抗體的氨基進(jìn)行偶聯(lián)，制備了第一種免疫磁性微球。最佳的偶聯(lián)條件為:微球的用量為0.01 g，活化緩沖液pH為5.4，偶聯(lián)時間為80 min。0.01g微球?qū)?2.6 mg/mL抗體

5、溶液的飽和偶聯(lián)量為25μL。同時研究了該免疫磁性微球?qū)嫫槟c桿菌的富集效果，結(jié)果表明:免疫磁性微球的最佳用量選擇0.01 g，在37℃、pH7.4時，富集60 min，對阪崎腸桿菌的富集效果最好。所制備的免疫磁性微球?qū)嫫槟c桿菌的富集有高度的特異性，與近緣菌株無交叉反應(yīng)，靈敏度高達(dá)到6 cfu/mL。免疫磁性殼聚微球的重復(fù)利用結(jié)果表明:每次用Gly-HCl緩沖液(0.1 mol/L、pH2.5)洗脫7 min，重復(fù)利用次數(shù)達(dá)到19次以上

6、。
　　(4)對磁性殼聚糖微球的表面用乙二胺進(jìn)行氨基改性，制備表面氨基化磁性殼聚糖微球。然后利用戊二醛將表面氨基化磁性殼聚糖微球和阪崎腸桿菌多克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制備的了第二種免疫磁性微球。最佳的偶聯(lián)條件為:微球的用量為0.01 g，偶聯(lián)緩沖液pH為7.4，偶聯(lián)時間為20 min。0.01 g微球?qū)?2.6mg/mL抗體溶液的飽和偶聯(lián)量為50μL。同時研究了該免疫磁性微球?qū)嫫槟c桿菌的富集效果，結(jié)果表明:免疫磁性微球的最佳用量選擇0

7、.01 g，在37℃、pH7.4時，富集45 min，對阪崎腸桿菌的富集效果最好。所制備的免疫磁性微球?qū)嫫槟c桿菌的富集有高度的特異性，與近緣菌株無交叉反應(yīng)，靈敏度高達(dá)到4 cfu/mL。免疫磁性微球的重復(fù)利用結(jié)果表明:每次用Gly-HCl緩沖液(0.1mol/L、pH2.5)洗脫9 min，重復(fù)利用次數(shù)達(dá)到27次以上。同時研究表明第二種免疫磁性微球?qū)嫫槟c桿菌的富集效果好于第一種免疫磁性微球。
　　(5)本研究以巰基化合物為穩(wěn)定

8、劑，首次采用超聲波輔助并用鹽水浴加熱的方法在pH為10的條件下，105℃回流合成了不同發(fā)射波長、熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性高、熒光壽命長的水溶性核殼結(jié)構(gòu)CdTe/CdS多色量子點(diǎn)。合成方法簡、高效且快速，為核殼結(jié)構(gòu)水溶性量子點(diǎn)制備開拓一片新領(lǐng)域。所制備的量子點(diǎn)呈球形，單分散性好，粒徑大約4 nm左右。熒光壽命為600 ms以上，室溫避光放置24個月，熒光強(qiáng)度幾乎沒有降低。
　　(6)本研究將阪崎腸桿菌多克隆抗體與CdTe/CdS半導(dǎo)體量子

9、點(diǎn)利用EDC和NHS進(jìn)行偶聯(lián)，制備了免疫熒光探針，最佳制備條件為:CdTe/CdS量子點(diǎn)的用量為125μL，抗體的用量為75μL，反應(yīng)體系的pH為8.2，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時間為2h。所制備的免疫熒光探針與CdTe/CdS量子點(diǎn)相比熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，熒光壽命無顯著變化，有很大的應(yīng)用價值和潛力。
　　(7)建立了免疫磁性微球富集和免疫熒光探針標(biāo)記相結(jié)合的快速檢測阪崎腸桿菌的方法，并利用該方法對牛奶中的阪崎腸桿菌進(jìn)行了檢測。檢測條件為

10、:250 mL待檢樣品稀釋液中加入0.05 g免疫磁性微球，調(diào)節(jié)pH為7.4，37℃振蕩富集60 min，磁分離并洗滌后加入50μL免疫熒光探針，37℃振蕩標(biāo)記60 min，整個檢測時間為2h。研究結(jié)果表明該方法對阪崎腸桿菌的檢測具有高度的特異性、與近緣菌株無交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確度高、時間穩(wěn)定性好，檢測限為15 cfu/mL。
　　嬰幼兒食品中阪崎腸桿菌的污染問題已經(jīng)引起人們的高度重視，但是目前還沒有成熟的快速檢測技術(shù)來對該致病性微生物