THAP11作為多聚谷氨酰胺疾病候選致病基因及候選抑癌基因的功能研究.pdf

1、背景：多聚谷氨酰胺(polyglutamin，po]yQ)疾病是一類神經(jīng)退行性疾病，該疾病是由于基因編碼區(qū)域存在的CAG三堿基出現(xiàn)多余重復(fù)，導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物中谷氨酰胺重復(fù)數(shù)增加而引發(fā)，目前尚有大量的致病基因未被揭示，F(xiàn)HAPll中含有一段由CAG編碼的谷氨酰胺串聯(lián)重復(fù)排列片段，那么其是否為polyQs疾病的候選致病基因呢?為此，尚需通過對正常人群和神經(jīng)退行性病變患者的THAPll基因中CAG重復(fù)數(shù)進行篩查，并對可能在患者中篩查到的含異常擴增

2、CAG的THAPll基因進行功能研究以進一步證實其為polyQ疾病的候選致病基因。另一方面，因THAP蛋白家族的其他成員是一類參與轉(zhuǎn)錄抑制，細(xì)胞凋亡及增殖抑制過程的蛋白，而且有的已被明確作為抑癌因子，那么THAPll是否也有可能為抑癌因子呢?為此，也尚需對其功能進行研究以驗證此假設(shè)。 目的： 1)通過檢查中國漢族正常人群THAPll基因的CAG重復(fù)數(shù)目，以獲悉其正常變動范圍，了解中國漢族人群中神經(jīng)退行性病變患者THAPl

3、l基因的CAG重復(fù)序列是否超過此正常變動范圍，探尋其作為多聚谷氨酰胺疾病致病基因的可能性。 2)通過對CAG重復(fù)數(shù)超過正常范圍的THAPll基因進行功能研究，進一步驗證其作為多聚谷氨酰胺疾病致病基因的可能性。 3)通過對THAFll兒基因的功能研究，探尋其作為抑癌基因的可能性。 方法：1)提取血液組織基因組DNA，PCR擴增，測序等，對中國漢族正常人群及神經(jīng)退行性病變的患者的THAPll基因中CAG重復(fù)序列數(shù)進行

4、調(diào)查，了解其基因型和分布等特征，明確患者該基因中CAG重復(fù)數(shù)是否超過正常范圍。 2)將含異常擴增CAG的THAPll構(gòu)建于pEGFP-N1綠色熒光表達載體及蛻皮激素誘導(dǎo)系統(tǒng)的pIND載體中，通過熒光顯微鏡觀察其細(xì)胞定位情況及有無蛋白聚合體這一特征性病變形成。 3)通過流式細(xì)胞儀檢測含異常擴增CAG的‘THAPll對細(xì)胞周期有無影響，并進一步通過Western blot檢測其對細(xì)胞周期蛋白的影響。4)通過采用染色質(zhì)-結(jié)構(gòu)檢

5、測技術(shù)，觀察TlIAPll對染色質(zhì)形態(tài)的影響，以提示對轉(zhuǎn)錄等方面的影響。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR對肝臟癌及癌旁組織的THAPllmRNA表達水平進行檢測，比較二者差異，并進一步采用Real time-PCR在肝癌細(xì)胞中檢測THAPll對原癌基因c-myc的mRNA表達水平的影響，同時還利用Westernblot從蛋白水平進行驗證，揭示其與癌癥發(fā)生的關(guān)系。 結(jié)果： 1)通過對中國漢族正常人群中THAPll基因的CAG重復(fù)序列進行

6、調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)其基因中CAG重復(fù)存在明顯的多態(tài)性，不僅表現(xiàn)在CAG重復(fù)數(shù)目上，還表現(xiàn)在CAG重復(fù)中存在著不同位置和數(shù)目的CAA的插入。其中，正常漢族人群CAG/CAA的重復(fù)數(shù)目從22個至34個不等，在該區(qū)間中，最常見的重復(fù)數(shù)為29，占總?cè)旧w數(shù)的69.6％，其中最常見基因型為(CAG)3CAA(CAG)5CAA(CAG)2CAA(CAG)5CAA(CAG)10，占總?cè)旧w數(shù)的62.35％；其次最常見CAG/CAA的重復(fù)數(shù)為28，占總?cè)旧?/p>

7、體數(shù)的14.5％。三核苷酸CAA在CAG中的插入數(shù)為2.6個不等，其中2個CAA的插入發(fā)生在23個和25個的CAG重復(fù)中，6個CAA的插入發(fā)生在29個CAG的重復(fù)中，最常見CAA插入數(shù)的是4個，未被其插入打斷的連續(xù)CAG最長重復(fù)數(shù)為15個。 2)通過對神經(jīng)退行性病變的患者T14APll基因中CAG重復(fù)數(shù)的篩查，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照相比患者TltAPll基因中存在不同程度的CAG重復(fù)擴增，不但發(fā)現(xiàn)了CAG重復(fù)數(shù)為35的突變THAPl

8、l(該類基因型分別存在2個患者異源染色體中，占1.66％)，而且還檢測到了CAG重復(fù)數(shù)為38的突變THAPll(存在于1個患者異源染色體中，占0.83％)，具體基因型為(CAG)3CAA(CAG)sCAA(CAG)2CAA(CAG)sCAA(CAG)aCAA(CAG)10。 3)通過對含異常擴增CAG的THAP11的細(xì)胞內(nèi)熒光定位觀察，我們發(fā)現(xiàn)THAPll(35Q)的蛋白與正常對照THAPll(290)相比，存在明顯的核內(nèi)蛋白表

9、達增強。而THAPll(38Q)不但具有核內(nèi)蛋白表達增強，而且還出現(xiàn)了蛋白聚合體沉淀。通過蛻皮激素可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，我們檢測出THAPll(38Q)蛋白最初為全細(xì)胞分布，隨著表達時間的延長，逐漸向核聚集，并形成蛋白聚合體而沉積。 4)通過檢測不同polyQs的THAPll對細(xì)胞周期的影響，未發(fā)現(xiàn)正常人群的THAPll(29Q)對細(xì)胞周期有影響；而THApll(38Q)卻可以引起明顯的G0/G1期阻滯，該期細(xì)胞占90.2496，較正

10、常58.52％明顯增高。進一步通過對細(xì)胞周期蛋白的檢測，我們發(fā)現(xiàn)THAPll(29Q)對相關(guān)細(xì)胞周期蛋白無明顯影響，而THAPll(38Q)可使細(xì)胞中P21蛋白表達增強，CyclinDl蛋白表達減弱，這兩種蛋白表達情況與我們檢測到的細(xì)胞G0/G1期阻滯一致。 5)通過采用染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測技術(shù)，我們觀察到THAPll可使染色質(zhì)發(fā)生濃縮，提示其可能具有轉(zhuǎn)錄抑制功能和作為抑癌因子。以此為線索，通過檢測THAPll在癌及癌旁正常組織中表達

11、量的變化情況，發(fā)現(xiàn)THAPll在癌組織的表達較癌旁正常組織明顯下降，從而進一步提示THAPll可能作為抑癌因子。此外，通過檢測THAPll對原癌基因c-myc的影響，我們發(fā)現(xiàn)其對c-myc無論是在mRNA水平還是蛋白水平均可抑制其表達，這更加確證了THAPll為候選抑癌基因。 結(jié)論： 1)檢測了中國漢族正常人群的THIPll基因的CAG重復(fù)序列的正常變動范圍為22-34，明確了其CAG重復(fù)數(shù)構(gòu)成的各種基因型及分布等特征

12、。 2)通過對具有-神經(jīng)退行性病變的患者的THAPll基因中CAG重復(fù)數(shù)的篩查，發(fā)現(xiàn)了1例神經(jīng)退行性病變的患者其THAPll基因中含有38個CAG重復(fù)，從而初步提示其發(fā)病可能與多聚谷氨酰胺疾病有關(guān)聯(lián)； 3)通過對含異常擴增CAG(38)的THAPll基因進行功能研究，發(fā)現(xiàn)該突變基因細(xì)胞內(nèi)表達可產(chǎn)生核內(nèi)包涵體這一多聚谷氨酰胺疾病的特征性病變，同時還存在對細(xì)胞周期G0/Gl期明顯阻滯，進一步提示其為多聚谷氨酰胺疾病的候選致病