結(jié)直腸癌的雌激素受體亞型α、β的表達(dá)及受體拮抗劑抑制作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectalcancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中列第四位，死亡率為第二位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)大腸癌的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，死亡率在上升，5年生存率仍徘徊不前，然而手術(shù)聯(lián)合放療化療效果并不十分理想，所以有必要探索治療結(jié)直腸癌新途徑。近年來，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證明某些非靶器官腫瘤如大腸癌組織中存在性激素受體，并開始研究其作用及探索內(nèi)分泌治療結(jié)直腸癌，有一些成功報(bào)道。1996年發(fā)現(xiàn)一種不同于原先人們熟

2、知的雌激素受體亞型并命名為雌激素受體β(estrogenreceptorβ，ERβ)，原先的ER則被命名為雌激素受體α(estrogenreceptorα，ERα)。臨床和實(shí)驗(yàn)的證據(jù)提示結(jié)腸癌細(xì)胞株、腫瘤組織中具有功能性ERβ的表達(dá)。但到目前為止，仍未完全清楚雌激素受體β在大腸癌中表達(dá)的意義。進(jìn)一步研究雌激素受體亞型α、β與大腸癌的相關(guān)關(guān)系將為臨床大腸癌的內(nèi)分泌治療提供可靠的理論依據(jù)和客觀指標(biāo)，從而探索治療結(jié)直腸癌新的途徑，這方面的工作

3、肯定是十分有意義的。 本研究探討了結(jié)直腸癌中雌激素受體亞型α、β的表達(dá)及其意義，并嘗試用雌激素受體拮抗劑進(jìn)行了體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分1114例大腸癌組織雌、孕激素受體狀況分析 目的：研究大腸癌患者癌組織雌孕激素受體狀態(tài)分布及與臨床病理因素的關(guān)系，探討ER、PR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義。 方法：回顧術(shù)后石蠟標(biāo)本用免疫組化方法進(jìn)行了雌、孕激素受體檢測(cè)的1114例大腸癌患者的臨床資料，建立數(shù)據(jù)庫，用統(tǒng)計(jì)軟

4、件對(duì)ER、PR的表達(dá)與患者的年齡、性別、原發(fā)腫瘤部位、大小、病理大體類型、組織類型、病理分級(jí)、腸壁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes'分期等臨床病理因素相結(jié)合進(jìn)行卡方檢驗(yàn)及單因素Logistic回歸分析(Enter法)，并建立多因素回歸模型采用非條件Logistic回歸分析(Forward：LR方法)。 結(jié)果：1.本組腸癌ER的表達(dá)率9.4％，PR的表達(dá)率是15.4％。ER(+)病例中PR(+)為97.9％，ER(-)病例中

5、PR(-)為80％，ER，PR一致率為92％。2.ER和PR的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。3.ER和PR的表達(dá)率和病理分級(jí)相關(guān)有顯著性意義(P＜0.05)。4.多因素Logistic回歸結(jié)果顯示ER和PR的表達(dá)率和年齡分布無關(guān)(P＞0.05)，與性別、原發(fā)腫瘤部位、大小、病理大體類型、組織類型、腸壁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes'分期之間關(guān)系無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論：部分大腸癌表達(dá)ER、PR，提示大腸癌可

6、能是性激素依賴性瘤，可為制定內(nèi)分泌治療提供依據(jù)。大腸癌患者雌孕激素受體狀態(tài)分布有一定的規(guī)律，對(duì)判斷病理分級(jí)有一定意義。 第二部分利用組織芯片研究ERα、ERβ的表達(dá) 目的：觀察ERα、ERβ在結(jié)直腸癌癌組織、癌旁組織中表達(dá)的情況。研究ERα、ERβ的表達(dá)與各病理因素及復(fù)發(fā)預(yù)后的關(guān)系。探討ERα、ERβ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義。 方法：收集1997～1998年95例手術(shù)治療結(jié)直腸癌臨床資料，均有明確病理診斷及完整的

7、隨訪記錄。利用組織芯片免疫組化法測(cè)定ERαERβ在結(jié)直腸癌癌組織、癌旁組織中表達(dá)的情況。對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行各病理因素卡方檢驗(yàn)及單因Logistic回歸分析(Enter法)并建立多因素回歸模型，采用非條件Logistic回歸分析(Forward：LR方法)，Kaplan-Meier生存分析法繪制生存曲線，Log-rank法進(jìn)行生存曲線比較。 結(jié)果：1.95例原發(fā)灶各取了兩點(diǎn)45例瘤旁正常組織取一點(diǎn)，制成1個(gè)受體蠟塊，共235個(gè)組織塊，

8、由于移位或脫失，最后可供數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的例數(shù)各指標(biāo)不等。2.本組結(jié)直腸癌癌組織ERα的表達(dá)率35.4％，ERβ的表達(dá)率78.0％。癌旁組織ERα的表達(dá)率9.5％，ERβ的表達(dá)率60.5％。3.癌組織ERβ的表達(dá)高于ERα(P＜0.05)，ERα的和ERβ的表達(dá)率無關(guān)(P＞0.05)4。結(jié)直腸癌癌組織ERα的和ERβ的表達(dá)高于癌旁組織(P＜0.05)。5.ERα的和ERβ的表達(dá)率和病理分級(jí)相關(guān)有顯著性意義(P＜0.05)。6.ERα的和ER

9、β的表達(dá)率和年齡分布無關(guān)(P＞0.05)，與性別、原發(fā)腫瘤部位、大小、病理大體類型、組織類型、腸壁浸潤(rùn)、有無淋巴、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes'分期之間關(guān)系無顯著差異(P＞0.05)。7.ERα的和ERβ的表達(dá)與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后無關(guān)(P＞0.05)。 結(jié)論：結(jié)直腸癌癌組織ERα的和ERβ的表達(dá)高于癌旁組織，對(duì)判斷病理分級(jí)有一定意義。ERα的和ERβ的表達(dá)率和年齡分布無關(guān)，與性別、原發(fā)腫瘤部位、大小、病理大體類型、組織類型、腸壁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)

10、轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes'分期無關(guān)。ERα的和ERβ的表達(dá)與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后無關(guān)。 第三部分ERβ在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及他莫昔芬對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株體外抑制實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討ERβ在結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、HT-29中的表達(dá)情況和他莫昔芬(tamoxifen，TAM)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用方法：體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、HT-29，用細(xì)胞爬片免疫組化方法、RT-PCR、Westernblot方法檢測(cè)ERα、ERβ

11、表達(dá)，用MTT比色法法檢測(cè)不同濃度的17β-E2、TAM、5-Fu、TAM+5-Fu、TAM對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)影響作用。用Burgi法：Q=平均E(A/2+B/2)/(平均EA/2+平均EB/2)分析藥物相互作用。流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定細(xì)胞胞凋亡率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析法。 結(jié)果： l、在結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、HT29中穩(wěn)定表達(dá)ERβ而不表達(dá)ERα。 2.TAM、5-Fu能抑制Lov

12、o、HT29細(xì)胞株的增殖，這種抑制作用呈劑量依賴性。各藥物對(duì)Lovo、HT29細(xì)胞株的IC50值：5-FuIC50值分別為3.81±0.34μmol/L和4.11±0.63μmol/L。TAM對(duì)Lovo、HT29細(xì)胞株IC50值分別為15.52±1.33μmol/L和16.23±2.85μmol/L。3.E在10-4-10-9M濃度下與對(duì)照組相比無顯著性差異(p＞0.05)。4、TAM與5-Fu協(xié)同對(duì)Lovo、HT29細(xì)胞株的Q值分別是

13、1.13±0.02和1.21±0.11，TAM能協(xié)同5-FU抑制Lovo、HT29細(xì)胞株的增殖。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明TAM有顯著促細(xì)胞凋亡的作用。TAM可協(xié)同5-FU對(duì)Lovo、HT29細(xì)胞株促細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)論：1、結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、HT29表達(dá)ERβ而不表達(dá)ERα。2、TAM以ERβ為靶點(diǎn)抑制Lovo、HT29細(xì)胞株的增殖，這種抑制作用呈劑量依賴性。3、TAM有顯著促結(jié)腸癌細(xì)胞株凋亡的作用。4、TAM協(xié)同5-FU抑

14、制Lovo、HT29細(xì)胞株的增殖，TAM協(xié)同5-FU對(duì)Lovo、HT29細(xì)胞株促細(xì)胞凋亡的作用。 第四部分他莫昔芬對(duì)荷瘤裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立荷人結(jié)腸癌的裸鼠動(dòng)物模型，觀察TAM、5-Fu、TAM+5-Fu對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響。 方法：裸鼠32只，雌雄各半，5-7周齡。體重：20-32g.成瘤方法：以荷人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo瘤裸鼠的移植瘤為瘤源接種。裸鼠成瘤后給藥三周，均分為TAM組、5-Fu

15、組、聯(lián)合組、對(duì)照組。給藥方法：TAM劑量為20mg/kg·d體重，capcitabine劑量為300mg/kg·d體重，制成懸溶液灌胃，每日2次，時(shí)間為三周。對(duì)照組相應(yīng)同時(shí)給等量生理鹽水。停藥48小時(shí)后處死。每3天測(cè)量體積，稱體重。處死后稱瘤重、體重、測(cè)量體積和用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定裸鼠移植瘤凋亡水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理進(jìn)行樣本檢驗(yàn)，用析因方差統(tǒng)計(jì)分析藥物相互作用。 結(jié)果：1.TAM組、Fu組、聯(lián)合組均可抑制腫瘤生長(zhǎng)(P＜0.05)。