GAP161聯(lián)合順鉑對腫瘤增殖與凋亡的影響及機制研究.pdf

1、1、研究背景和目的：
　　惡性腫瘤嚴重威脅人類生命健康，其死亡率僅次心血管疾病[1]。針對腫瘤的治療，臨床主要采取手術切除、放射治療與化療的方式。其中，化療在癌癥的治療中占重要地位。理想的化療是對腫瘤細胞有選擇性的殺傷，而對正常細胞無明顯毒性，由于癌細胞與人正常組織細胞間缺乏根本性的代謝差異，使大部分化療藥物的選擇性較差，對腫瘤細胞的特異性不高，毒副作用強烈，治療效果不盡如人意。非特異性化療藥物順鉑就是其中之一。其屬于金屬鉑類制劑

2、，適用于胃癌、乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、前列腺癌等[2]，是目前臨床運用最廣，作用最強的抗腫瘤藥物之一[3]，但由于毒性作用較大，劑量的增加往往導致不良反應的增多，長期反復使用易產生多藥耐藥等，使其臨床應用受到一定的限制。因此，如何解決順鉑毒性大，減輕其嚴重的耳腎毒性，提高藥物的療效，已成為腫瘤科亟待解決的實際問題。針對以上問題，研究者們開展了多方面的研究。如多方式的聯(lián)合用藥，靶向藥物的研制等。
　　G3BP屬于RNA結合蛋白家族成

3、員，是一種RasGAP SH3結構域段特異性結合蛋白，其參與Ras的下游傳導通路。G3BP N-端都具有NTF2樣結構域，Kennedy等[4]發(fā)現(xiàn)RasGAP的SH3結構域與G3BP的結合是依賴于與NTF2樣結構域結合，從而參與RasGAP的信號傳導。Ras是一個原癌基因，具有GTPase活性，通過受體酪氨酸激酶激活信號傳導級聯(lián)反應。Ras信號途徑參與多種細胞活動，包括細胞生長、分化、細胞骨架的形成和蛋白轉運等。RasGAP可促進Ra

4、s GTPase的活性，將活性RasGTP水解為無活性RasGDP，從而達到負性調節(jié)Ras的活性?；谝陨涎芯亢驼J識，人們推斷G3BP與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關，以G3BP為靶點的抗腫瘤藥物研究具有廣闊的前景。肽GAP161就是以G3BP為靶標合理設計出來的。
　　本研究目的在于通過多種實驗方法不同角度初步探討以G3BP為靶點所設計的全新多肽藥物GAP161聯(lián)合順鉑對腫瘤增殖與凋亡的影響，為進一步挖掘二者聯(lián)合用藥在抗腫瘤

5、方面存在的潛能提供理論依據。
　　2、研究方法：
　　體外培養(yǎng)人肝癌HepG2、人結腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782細胞株。采用MTT法檢測不同濃度的GAP161單用及聯(lián)合順鉑對細胞增殖的影響。
　　采用Hoechst33342單染技術觀察多肽GAP161單用及聯(lián)合順鉑對乳腺癌MA-782細胞凋亡形態(tài)的影響，應用流式細胞術雙染法檢測GAP161單用及聯(lián)合順鉑對乳腺癌MA-78

6、2細胞凋亡的影響。
　　采取最大劑量單次給藥來評價GAP161的安全性。
　　建立小鼠乳腺癌腫瘤模型，通過繪制瘤體生長曲線，稱瘤重，觀察藥物對小鼠移植瘤生長的影響，從而計算抑瘤率。
　　運用HE染色的手段，觀察各處理組藥物對小鼠瘤體及肝、腎、脾相關內臟病理學的改變。采用免疫組化的方法，檢測藥物對小鼠移植瘤細胞凋亡相關蛋白表達的影響。
　　3、研究結果：
　　1、GAP161和順鉑對多種腫瘤細胞均有劑量依賴性

7、的抗增殖作用。聯(lián)合給藥組表現(xiàn)為協(xié)同作用，較順鉑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），在相同的抑癌效果下可降低順鉑的使用量;且在相同濃度梯度下，聯(lián)合用藥組對Panc-1的抑制效果較差，對MA-782效果最好。
　　2、倒置顯微鏡觀察，聯(lián)合用藥組細胞與順鉑組相比，MA-782細胞形態(tài)改變愈加明顯。對MA-782細胞行Hoechst33342染色，結果顯示，聯(lián)合用藥組細胞凋亡形態(tài)特征與順鉑組相比更為顯著，染色質凝集現(xiàn)象增多;流式細胞術

8、檢測顯示，與順鉑組相比，聯(lián)合給藥組細胞早期凋亡率顯著升高，其凋亡率由(30.03±0.93)％增至(61.67±0.81)％，差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、急性毒性試驗結果表明，多肽GAP161對小鼠無明顯急性毒性作用。
　　4、GAP161組，順鉑組，GAP161聯(lián)合順鉑組抑瘤率分別為:5.37％，38.63％，53.52％。瘤體HE染色結果顯示GAP161組，順鉑組同聯(lián)合用藥組的腫瘤細胞均發(fā)生部分壞死、核固

9、縮且聯(lián)合用藥組愈加明顯。小鼠主要內臟器官HE染色結果表明，GAP161在增強順鉑化療療效的同時并未增加其毒副作用。免疫組化結果證實，聯(lián)合給藥組與GAP161組，順鉑組及陰性對照組比較，其小鼠腫瘤組織內Survivin蛋白表達明顯減弱、Caspase-3蛋白表達顯著增強，且具統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　4、結論：
　　GAP161聯(lián)合順鉑在體外對多種腫瘤細胞具抗增殖效應，且兩藥聯(lián)合具協(xié)同作用。GAP161聯(lián)合順鉑誘導乳腺