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1、目的:通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)得到保守基序的各種突變體(p20l/a、p20s1/a、p20k/a、p20i/a、p20v1/a、p20v2/a),并通過(guò)Westernblotting探討保守基序中各氨基酸對(duì)大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影響。 方法: 1、采用定點(diǎn)突變技術(shù),設(shè)計(jì)相應(yīng)突變引物,以p20為模板,基于。PCR擴(kuò)增得到突變體,并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。 2、用質(zhì)粒中量提取試劑盒得到足量的質(zhì)粒,然后利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipof
2、ectAMINE將各突變體及p20轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中。 3、通過(guò)Westernblotting檢測(cè)各突變體的表達(dá),采用Quantityone分析各種突變體未酶切和酶切部分的表達(dá)強(qiáng)度,并分析未酶切部分所占比例。 結(jié)果: 1、使用PCR定點(diǎn)突變的方法,獲得突變體,經(jīng)序列測(cè)定后利用clustalx1.83軟件與模板p20比對(duì),證實(shí)突變完全成功。并通過(guò)質(zhì)粒中量提取獲得了足量的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。 2、裂解細(xì)胞后將細(xì)
3、胞裂解物進(jìn)行Westernblotting免疫印跡實(shí)驗(yàn),證實(shí)在55kDa處存在未酶切的部分,在30kDa處存在可被抗V5抗體檢測(cè)的N端部分,經(jīng)過(guò)Quantityone分析后發(fā)現(xiàn),S2/A完全抑制了酶切的發(fā)生,G/A抑制了絕大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/A、I/A、V1/A、V2/A均對(duì)酶切產(chǎn)生了不同程度的抑制,未酶切部分分別為22%、39%、14%和17%,而:K/A和S1/A幾乎對(duì)酶切沒(méi)有影響,其未酶切部分分別為6%和3%,
4、酶切效率與p20(未酶切部分占4%)幾乎一樣。 結(jié)論:以p20為模板的各種突變體突變成功,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所有突變體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞并獲得了相應(yīng)突變體的高效表達(dá)。通過(guò)Westernblotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸對(duì)其蛋白酶切的發(fā)生是很重要的,其機(jī)理可能是因?yàn)榇吮J鼗蛭挥讦?和β3片層之間的環(huán)狀區(qū),其上的氨基酸對(duì)于維持粘蛋白的構(gòu)象是必須的。在S1上可能有O型糖鏈的存在,并且去
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