大鼠粘蛋白rMuc3酶切保守基序?qū)ζ涞鞍酌盖械挠绊懙难芯?pdf

1、目的：通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)得到保守基序的各種突變體(p20l/a、p20s1/a、p20k/a、p20i/a、p20v1/a、p20v2/a)，并通過(guò)Westernblotting探討保守基序中各氨基酸對(duì)大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影響。 方法： 1、采用定點(diǎn)突變技術(shù)，設(shè)計(jì)相應(yīng)突變引物，以p20為模板，基于。PCR擴(kuò)增得到突變體，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。 2、用質(zhì)粒中量提取試劑盒得到足量的質(zhì)粒，然后利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipof

2、ectAMINE將各突變體及p20轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中。 3、通過(guò)Westernblotting檢測(cè)各突變體的表達(dá)，采用Quantityone分析各種突變體未酶切和酶切部分的表達(dá)強(qiáng)度，并分析未酶切部分所占比例。 結(jié)果： 1、使用PCR定點(diǎn)突變的方法，獲得突變體，經(jīng)序列測(cè)定后利用clustalx1.83軟件與模板p20比對(duì)，證實(shí)突變完全成功。并通過(guò)質(zhì)粒中量提取獲得了足量的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。 2、裂解細(xì)胞后將細(xì)

3、胞裂解物進(jìn)行Westernblotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在55kDa處存在未酶切的部分，在30kDa處存在可被抗V5抗體檢測(cè)的N端部分，經(jīng)過(guò)Quantityone分析后發(fā)現(xiàn)，S2/A完全抑制了酶切的發(fā)生，G/A抑制了絕大部分的酶切(未酶切部分占79％)，L/A、I/A、V1/A、V2/A均對(duì)酶切產(chǎn)生了不同程度的抑制，未酶切部分分別為22％、39％、14％和17％，而：K/A和S1/A幾乎對(duì)酶切沒(méi)有影響，其未酶切部分分別為6％和3％，

4、酶切效率與p20(未酶切部分占4％)幾乎一樣。 結(jié)論：以p20為模板的各種突變體突變成功，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所有突變體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞并獲得了相應(yīng)突變體的高效表達(dá)。通過(guò)Westernblotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸對(duì)其蛋白酶切的發(fā)生是很重要的，其機(jī)理可能是因?yàn)榇吮Ｊ鼗蛭挥讦?和β3片層之間的環(huán)狀區(qū)，其上的氨基酸對(duì)于維持粘蛋白的構(gòu)象是必須的。在S1上可能有O型糖鏈的存在，并且去