阿扎那韋對(duì)hERG鉀通道電生理功能及蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 臨床上心律失常的發(fā)生常和心肌細(xì)胞離子通道的功能障礙有關(guān)。由人類human ether-a-go-go相關(guān)基因(hERG)編碼的快速激活延遲整流鉀通道(rapidactivating delayed rectifier K+ channel,Ikr)在人類生理和病理過(guò)程中起著重要作用。人類心肌細(xì)胞中,hERG鉀通道影響心臟動(dòng)作電位的復(fù)極化過(guò)程,是絕大多數(shù)藥物引起心肌細(xì)胞QT間期延長(zhǎng)作用的靶點(diǎn)。目前臨床廣泛使

2、用的各種非心血管藥物如抗精神病藥、抗瘧藥、抗菌藥、抗組胺藥等對(duì)心肌細(xì)胞膜上hERG通道產(chǎn)生的鉀電流有阻斷作用,導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng),可產(chǎn)生多形性室速、尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(Torsades de pointes,Tdp)或室顫。長(zhǎng)QT綜合征(LongQT syndrome,LQTS)可分為遺傳性LQTS和獲得性LQTS二類。目前臨床上發(fā)現(xiàn)的多為獲得性LQTS。阿扎那韋是新型的蛋白酶抑制劑,在臨床上與其他的蛋白酶抑制劑及逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑合用治

3、療艾滋病。臨床發(fā)現(xiàn),隨著醫(yī)療衛(wèi)生條件的提高,HIV患者的壽命也在不斷延長(zhǎng),但是心律失常在這些人群中的發(fā)生率也在不斷升高,表現(xiàn)為QT間期延長(zhǎng),P-R間期延長(zhǎng)等。但是這些患者本身可能沒(méi)有心臟疾病。推測(cè)HIV患者的心律失?？赡芘c服用藥物有關(guān)。阿扎那韋的同類藥物在臨床應(yīng)用中有致心律失常的風(fēng)險(xiǎn),能引起LQTS,甚至發(fā)生Tdp,導(dǎo)致心源性猝死,而且已在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能引起QT間期延長(zhǎng)。但是目前文獻(xiàn)中對(duì)阿扎那韋致QT間期延長(zhǎng)的臨床報(bào)道是有爭(zhēng)議的,甚

4、至是矛盾的,也缺乏關(guān)于體外實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。因此,本課題將著力探討阿扎那韋致QT間期延長(zhǎng)的可能分子機(jī)制,為指導(dǎo)臨床個(gè)體化給藥提供理論依據(jù),降低患者心臟不良反應(yīng)的發(fā)生率。
　　 材料與方法：
　　 1.藥物
　　 阿扎那韋購(gòu)于美國(guó)sigma公司,溶于甲醇中配制成10 mM的母液,室溫保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM或正常臺(tái)氏液稀釋成不同濃度的阿扎那韋。甲醇的終濃度小于0.1％時(shí),對(duì)hERG鉀電流的記錄無(wú)顯著影響。
　　 2

5、.HEK-293細(xì)胞的培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
　　 人類胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney cell line,HEK-293)在含有10%優(yōu)級(jí)胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),并放置在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并傳代。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70～80%密度左右時(shí),用0.25%的胰酶消化傳代,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌韵鄳?yīng)密度接種于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。參照Lipofect

6、amineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒類型如下:①野生型pcgi-WT-hERG②突變型pcgi-Y652A-hERG和pcgi-F656C-hERG。
　　 3.應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄hERG鉀通道電流
　　 在熒光顯微鏡下找出有綠色熒光的單個(gè)HEK-293細(xì)胞,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)方案,分別記錄阿扎那韋對(duì)野生型hERG、突變型Y652A-hERG和F656C-hERG鉀通道電流

7、及其動(dòng)力學(xué)特征的變化。
　　 4.Western blotting方法檢測(cè)hERG蛋白的表達(dá)
　　 阿扎那韋孵育24 h后,胰酶消化收集細(xì)胞,RIPA裂解提取蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度,9%的SDS-PAGE凝膠電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉,抗hERG一抗(1:400),4℃孵育低速搖床過(guò)夜,HRP標(biāo)記的二抗(1:10000),室溫孵育1 h,ECL化學(xué)法顯色。通過(guò)Quantity one軟件分析膠片中每條帶的

8、灰密度值,并與自身內(nèi)參GAPDH條帶的灰密度相比,以對(duì)每條帶完成半定量分析。
　　 5.激光共聚焦技術(shù)定位hERG蛋白
　　 將經(jīng)阿扎那韋孵育24 h的轉(zhuǎn)染有WT-hERG鉀通道的HEK-293細(xì)胞應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)進(jìn)行定位,FITC(綠色)和DAPI(藍(lán)色)應(yīng)用波長(zhǎng)分別為488和408 nm的激光激發(fā)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用mean±S.E.M進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,SPSS12.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,

9、用Origin6.0軟件制圖,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.阿扎那韋直接抑制野生型WT-hERG鉀電流(Ikr)
　　 將轉(zhuǎn)染有hERG基因的HEK-293細(xì)胞分別給予0.01、0.1、1、3、10和30μM的阿扎那韋,同時(shí)記錄hERG電流的變化。阿扎那韋對(duì)野生型WT-hERG電流呈濃度依賴性抑制,抑制率依次為(11.95±2.65)%、(22

10、.60±5.29)%、(34.22±8.52)%、(41.36±9.80)%、(55.80±4.69)%和(73.22±7.02)%。阿扎那韋對(duì)WT-hERG電流的IC50值為5.73±1.81μM,Hill系數(shù)為0.38±0.06。阿扎那韋對(duì)WT-hERG的激活曲線作用的結(jié)果顯示:加藥前的半數(shù)激活電壓(V1/2)為12.53±0.66 mV,激活斜率(k)為13.62±0.58 mV,而加入10μM阿扎那韋后的V1/2為17.81±0

11、.82mV,k為15.01±0.72 mV,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。阿扎那韋對(duì)WT-hERG的失活曲線作用的結(jié)果顯示:加藥前的半數(shù)失活電壓(V1/2)為-61.06±0.94 mV,失活斜率(k)為24.13±0.86 mV,而加入10μM阿扎那韋后的V1/2為-56.28±1.12 mV,k為23.72±1.03 mV,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理也無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。由阿扎那韋對(duì)突變體Y652A-hERG及F656C-h

12、ERG鉀通道的作用可以看到,10和30μM阿扎那韋對(duì)突變體Y652A-hERG鉀通道的抑制率分別為(30.83±2.87)%和(39.19±2.74)%。與野生型相比,Y652A-hERG的突變一定程度上削弱了阿扎那韋抑制WT-hERG鉀通道的能力。在HEK-293細(xì)胞中F656C-hERG的表達(dá)量很低,不易引出外向電流,因此我們用高鉀的細(xì)胞外液引出其內(nèi)向電流。當(dāng)阿扎那韋的濃度為10和30μM時(shí),其對(duì)WT-hERG鉀通道內(nèi)向電流分別抑制

13、了(35.44±1.22)%和(47.91±5.67)%;而對(duì)F656C-hERG鉀通道則分別抑制了(15.31±5.0)%和(18.41±4.7)%?？梢?jiàn),F656C-hERG的突變同樣明顯削弱了阿扎那韋抑制WT-hERG鉀通道的能力。
　　 2.阿扎那韋對(duì)hERG蛋白運(yùn)輸?shù)挠绊?br>　　 將轉(zhuǎn)染有hERG基因的HEK-293細(xì)胞分別給予0.1、0.3、1、3、10和30μM的阿扎那韋孵育,24 h后提蛋白進(jìn)行Wester

14、n blot檢測(cè)。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,155 kDa條帶的灰密度值隨著阿扎那韋濃度的增大而減少,阿扎那韋對(duì)hERG鉀通道蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性的抑制,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.05 vscontrol)。
　　 3.共聚焦技術(shù)對(duì)hERG蛋白的亞細(xì)胞定位
　　 結(jié)果顯示hERG鉀通道蛋白主要在細(xì)胞膜上。阿扎那韋處理后細(xì)胞膜上的綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱,熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 結(jié)論：
　　 阿