Runx3調(diào)節(jié)BPD新生鼠肺泡Ⅱ型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、前言：
　　支氣管肺發(fā)育不良(BPD)是與早產(chǎn)兒相關(guān)的主要并發(fā)癥之一，它是神經(jīng)發(fā)育損害的危險因素，也是生長發(fā)育遲緩的高危因素。近年來，隨著產(chǎn)前糖皮質(zhì)激素、肺表面活性物質(zhì)及肺保護(hù)性通氣策略的應(yīng)用，早產(chǎn)兒的存活率逐漸增加，伴隨而來的是與早產(chǎn)相關(guān)的BPD的發(fā)生率居高不下。2012年的一項臨床研究證實，在極低出生體重兒(出生體重＜1000g)中，BPD的發(fā)病率為52％。因此，為了改善早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量，如何預(yù)防和治療BPD成為目前函待解決的

2、問題。
　　最早的BPD的概念是1967年Northway等人提出，現(xiàn)在稱為“經(jīng)典”或“老”BPD。這些患兒從出生時起就存在著嚴(yán)重的呼吸衰竭，經(jīng)歷了長時間吸入高濃度氧及侵入性機械通氣，最終發(fā)展為慢性呼吸衰竭。其病理學(xué)改變嚴(yán)重，包括肺氣腫、肺不張、肺纖維化、嚴(yán)重的氣道上皮的鱗狀化生及肺脈管系統(tǒng)的平滑肌增生肥大等。這些病理改變與嚴(yán)重的呼吸衰竭、肺動脈高壓及肺源性心臟病密切相關(guān)。與病理學(xué)改變相對應(yīng)，“經(jīng)典/老”BPD有特征性的胸部放射學(xué)

3、表現(xiàn)，包括肺充氣過度、肺不張、彌漫的肺纖維化等。這些BPD患兒有嚴(yán)重的呼吸道癥狀及典型的胸片表現(xiàn)，因此診斷并不困難。隨著肺表面活性物質(zhì)及肺“溫和”通氣策略（如允許性高碳酸血癥）的應(yīng)用，BPD的臨床表現(xiàn)更輕，病理及胸部放射學(xué)與以往“老”BPD相比明顯不同。這些較“輕”的BPD的病理學(xué)改變主要包括:肺液體增加、彌漫性的炎癥反應(yīng)、肺分隔明顯減低和血管發(fā)育受損。而胸部放射學(xué)經(jīng)常僅僅表現(xiàn)為肺野模糊（反應(yīng)了肺容量減少或肺內(nèi)液體增加），偶爾也會出現(xiàn)肺

4、段致密區(qū)、肺不張及肺炎浸潤的表現(xiàn)，但沒有“經(jīng)典/老”BPD的肺過度充氣的表現(xiàn)。
　　肺泡發(fā)育障礙是“新”BPD的主要病理改變，有關(guān)其發(fā)病機制并不是很清楚。我們課題小組以往的研究在肺泡上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，由此我們想到了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT是指上皮細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)分化變成間質(zhì)細(xì)胞。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種上皮細(xì)胞能夠發(fā)生EMT，如肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、

5、人的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞等。是否在新生鼠BPD模型中存在著EMT還不得而知。本研究通過體內(nèi)、外實驗證實是否在BPD中存在這一過程，并且尋找其發(fā)生機制。EMT的發(fā)生機制復(fù)雜，涉及到許多細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。目前Runx3在EMT發(fā)生過程中的作用正在日益受到人們的關(guān)注。目前的研究已經(jīng)證實了Runx3是肺發(fā)育中的重要影響因素。近來，Lee等證實了Runx3在肺發(fā)育EMT過程中的作用。他們的研究結(jié)果表明:在Runx3敲除的鼠肺內(nèi)存在著異常的EM

6、T過程，導(dǎo)致肺泡發(fā)育異常。本研究以此為基礎(chǔ)，在建立此BPD模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過形態(tài)學(xué)觀察、蛋白和基因表達(dá)的測定，試圖證實Runx3能夠調(diào)節(jié)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial typeⅡ cells(AT2)經(jīng)歷EMT過程，從而為BPD的防治提供了新的理念。
　　材料與方法：
　　一、實驗分組及標(biāo)本的采集
　　1、動物模型的建立及肺組織標(biāo)本的采集
　　所用的實驗動物新生Wist

7、ar大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。將生后12h內(nèi)的新生鼠隨機分為兩組，一組為對照組，另一組為BPD組。BPD組的新生鼠生后即置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持氧濃度為0.90，持續(xù)監(jiān)測氧濃度（美國OM—25ME型測氧儀監(jiān)測），用鈉石灰吸收CO2，使其濃度小于0.5％，溫度為25-27℃，濕度50％-70％，每天開箱10分鐘，添加水及飼料，更換墊料，并每天與空氣對照組互換代母鼠以避免因氧中毒而致護(hù)理能力降低;對照組置于空氣中

8、（氧濃度21％），具體方法及控制因素同空氣組。
　　實驗開始后的第1、3、7、14、21d，分別從每組隨機抽取8只新生鼠，提取肺組織。腹腔內(nèi)注射10％的水合氯醛(3ml/kg)進(jìn)行麻醉，然后打開胸腔，分離肺組織。左肺置于4％的多聚甲醛中進(jìn)行固定，用于HE染色和免疫熒光。右肺放在液氮中用于mRNA和western-blotting檢測。另外，從左肺組織切取1mm3大小的肺組織并固定于2.5％的戊二醛中，用于透射電鏡觀察。
　　

9、2、原代肺泡2型上皮細(xì)胞的分離和純化
　　按照我們以往的建立的方法分別提取兩組的第1、3、7、14、21d的肺泡2型上皮細(xì)胞。收集純化的AT2細(xì)胞，-80度保存用于western-blotting、 Real-Time PCR檢測;AT2細(xì)胞爬片用于肺泡2型細(xì)胞的抗原鑒定。
　　3、RLE-6TN細(xì)胞系培養(yǎng)
　　RLE-6TN細(xì)胞系購自美國ATCC公司。Runx3過表達(dá)質(zhì)粒和Runx3干擾siRNA由上海吉凱基因構(gòu)建并

10、合成。正常培養(yǎng)的RLE-6TN細(xì)胞系，待細(xì)胞融合達(dá)70％時進(jìn)行基因干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，所用轉(zhuǎn)染試劑為lipo2000。
　　根據(jù)細(xì)胞的干預(yù)條件，將實驗分為五組:
　　對照組:正常RLE-6TN細(xì)胞單層。
　　Runx3組:Runx3過表達(dá)的RLE-6TN細(xì)胞單層，正常RLE-6TN細(xì)胞單層與Runx3過表達(dá)質(zhì)粒作用72h。
　　siRunx3組:Runx3基因沉默RLE-6TN單層，正常RLE-6TN單層與siRun

11、x3作用72h。
　　TGF-β1組:用2.5ng/ml的TGF-β1刺激RLE-6TN細(xì)胞單層，作用48h。
　　TGF-β1+Runx3組:正常RLE-6TN細(xì)胞單層與Runx3過表達(dá)質(zhì)粒作用24h后，再加入2.5ng/ml的TGF-β1刺激RLE-6TN細(xì)胞單層，繼續(xù)作用48h。
　　二、實驗方法及檢測指標(biāo)
　?。ㄒ唬〣PD病理形態(tài)學(xué)研究
　　1、光鏡觀察:肺組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下動態(tài)觀察肺

12、組織的病理改變。
　　2、放射狀肺泡計數(shù)(radial alveolar counts，RAC)
　　3、肺泡間隔厚度的測量
　?。ǘ┓谓M織中EMT現(xiàn)象的檢測
　　1、免疫熒光雙標(biāo)
　　用免疫熒光雙標(biāo)的方法，同時標(biāo)記AT2的標(biāo)志物肺表面活性蛋白C(surfact antprotein C，SPC)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，觀察肺組織中肺泡

13、2型上皮細(xì)胞的EMT現(xiàn)象。同時計算肺泡發(fā)育指標(biāo)α-SMA陽性肺泡繼發(fā)性分隔的百分率。
　　2、透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)，觀察發(fā)生EMT的AT2的超微結(jié)構(gòu)改變。
　　3、western-blot和real-time PCR技術(shù)檢測肺組織中SPC、α-SMA、E-鈣粘蛋白(E-cad)、N-鈣粘蛋白(N-cad)的表達(dá)。
　　（三）原代提取的AT2中EMT標(biāo)志物的

14、檢測(SPC、α-SMA、E-cad、N-cad)
　　采用western-blot和real-time PCR技術(shù)，檢測兩組不同時間點原代培養(yǎng)的AT2細(xì)胞中SPC、α-SMA、E-cad、N-cad的基因及蛋白的表達(dá)。
　　（四）肺組織及原代提取的AT2細(xì)胞中Runx3的表達(dá)及與肺發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　1、免疫組化(immunohistochemisty，IHC)，觀察肺組織中Runx3的表達(dá)
　　2、采用

15、western-blot和real-time PCR技術(shù)，檢測兩組不同時間點肺組織和原代培養(yǎng)的AT2細(xì)胞中Runx3的基因及蛋白的表達(dá)。
　　3、Spearman相關(guān)性分析，分析Runx3與肺泡發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性。
　?。ㄎ澹㏑unx3的表達(dá)改變對RLE-6TN細(xì)胞EMT的影響
　　1、通過western-blot和real-time PCR技術(shù)，進(jìn)行Runx3基因沉默及過表達(dá)的效果的驗證。
　　2、通過SPC和α

16、-SMA的雙標(biāo)免疫熒光，分析各組細(xì)胞的EMT現(xiàn)象
　　3、透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變
　　4、通過western-blot和real-time PCR技術(shù)，分析各組EMT相關(guān)指標(biāo)的基因和蛋白的表達(dá)改變(SPC、α-SMA、E-cad、N-cad)。
　　三、統(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS11.5.統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，單因素多水平比較采用單因素方差分析(One-way

17、 ANOVA)，兩樣本均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗（independent t-test）或成對樣本t檢驗。相關(guān)分析采線性相關(guān)性分析(Spearman)，結(jié)果以P＜0.05有意義。
　　結(jié)果：
　　一、兩組肺組織形態(tài)學(xué)改變及RAC值、肺泡間隔厚度及α-SMA陽性的繼發(fā)性肺分隔百分率的比較
　　（一）、肺組織病理學(xué)改變
　　對照組第1d，肺泡樣結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肺泡隔數(shù)量少，和模型組相比沒有明顯的形態(tài)學(xué)不同。在對照組第3

18、d，肺泡和肺泡隔的數(shù)量增加，肺泡隔變薄。而在模型組第三天，肺泡隔增厚。在對照組第7d，肺泡和肺泡隔數(shù)量明顯增加，肺泡隔繼續(xù)變薄，肺泡大小一致。而在模型組第7d，肺泡數(shù)量減少，肺泡腔變大。在對照組14d和21d，肺泡變得更加規(guī)則，肺泡大小一致，肺泡和肺泡隔更加密集。在模型組14d和21d，肺泡腔明顯增大，肺泡隔明顯增厚，肺泡數(shù)量減少，肺泡的正常結(jié)構(gòu)消失。
　　（二）兩組RAC比較
　　第1、3d兩組之間物顯著性差異。而對照組第

19、7、14、21d的RAC值明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);并且對照組RAC值隨生后的日齡而逐漸增加，第7、14、21d的RAC值明顯高于第1天(P＜0.01)。
　?。ㄈ┓闻蓍g隔厚度比較
　　對照組肺泡間隔厚度隨日齡的增加逐漸變薄;實驗組肺泡間隔逐漸增寬。1d和3d對照組同實驗組比較無明顯差異;7d、14d和21d時實驗組組肺泡間隔較同期對照組明顯增寬，差異顯著（P＜0.01）。
　　（四）、α-S

20、MA陽性的繼發(fā)性肺分隔百分率的比較
　　通過α-SMA的免疫熒光，發(fā)現(xiàn)在兩組肺組織中第1、3d的表達(dá)無明顯差異。對照組，從第7d開始，α-SMA的表達(dá)逐漸增加，主要表達(dá)于繼發(fā)性肺分隔的頂端。而模型組α-SMA的表達(dá)，第14d、21d主要表達(dá)于肺間質(zhì)。第7、14、21d時間點α-SMA陽性的繼發(fā)性肺泡分間隔的百分率，BPD模型組明顯低于對照組。
　　二、肺組織中EMT相關(guān)的免疫熒光雙標(biāo)(SPC和α-SMA)
　　在對照組

21、，紅色的SPC熒光和綠色的α-SMA熒光散在分布于肺泡壁和肺泡隔中，但沒發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記物共表達(dá)的細(xì)胞。在模型組第1、3d，也沒發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中標(biāo)記物的共表達(dá)現(xiàn)象。在模型組第7d，一些細(xì)胞的胞漿中可見橙色的SPC和α-SMA共表達(dá)的熒光，在第14d和21d，可見橙色熒光強度較第7d增強。
　　三、肺組織AT2的超微結(jié)構(gòu)改變(TEM)
　　用透射電鏡觀察AT2的超微結(jié)構(gòu)改變。在對照組，可見正常的肺泡2型細(xì)胞呈立方型，細(xì)胞頂端有微絨毛，細(xì)

22、胞漿內(nèi)可見特征性的板層小體。在模型組的第1、3d，沒有發(fā)現(xiàn)與EMT形態(tài)學(xué)相關(guān)的肺泡2型上皮細(xì)胞。在模型組第7d，可見部分肺泡2型細(xì)胞內(nèi)的板層小體空泡化，特征性的束狀的actin微絲分布于肺泡2型細(xì)胞的胞漿中。
　　四、肺組織中EMT相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)改變(SPC、α-SMA、E-cad、 N-cad)
　　（一）、肺組織中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)改變
　　在第1、3d時，兩組比較SPC、α-SMA、E-cad、N-c

23、ad蛋白的表達(dá)均無明顯差異。模型組14、21d，SPC、α-SMA蛋白的表達(dá)明顯高于對照組;第7、14、21d，模型組E-cad蛋白的表達(dá)均低于對照組，而N-cad蛋白的表達(dá)均高于對照組。
　?。ǘ?、肺組織中EMT相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)改變
　　第1、3d時，兩組間比較SPC、α-SMA、E-cad、N-cad mRNA無明顯差異。兩組之間比較，模型組14、21d，SPC mRNA的表達(dá)明顯高于對照組。第7、14和21d，

24、模型組的α-SMA mRNA、N-cad mRNA的表達(dá)均高于對照組，E-cadmRNA的表達(dá)水平明顯低于對照組。
　　五、原代提取的肺泡2型上皮細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)改變
　　（一）、原代提取的AT2中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)改變
　　第1、3d時，兩組間比較EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)無明顯差異。模型組第7、14、21d，上皮細(xì)胞標(biāo)志物SPC、E-cad蛋白的表達(dá)均低于對照組，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、N-

25、cad蛋白的表達(dá)均高于對照組。
　　(二)、原代提取的AT2中EMT相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)改變
　　與蛋白的表達(dá)結(jié)果類似，第1、3d時，兩組間比較EMT相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)無明顯差異。模型組第7、14、21d，上皮細(xì)胞標(biāo)志物SPC、E-cad的mRNA表達(dá)均低于對照組，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、N-cad mRNA的表達(dá)均高于對照組。
　　六、肺組織中Runx3蛋白和mRNA的表達(dá)改變
　　（一）、免疫組織化

26、學(xué)技術(shù)分析Runx3蛋白的表達(dá)
　　在兩組肺組織中，所選取的不同時間點，均發(fā)現(xiàn)Runx3的表達(dá)。對照組Runx3與第7d開始表達(dá)增加，持續(xù)至21d。而BPD模型組肺組織，從第7天開始，Runx3的表達(dá)減少
　　（二）、肺組織中Runx3蛋白及mRNA表達(dá)改變
　　第7、14和21d，模型組的Runx3蛋白和mRNA的表達(dá)均低于對照組。
　　七、原代提取的肺泡2型上皮細(xì)胞中Runx3蛋白及mRNA的表達(dá)
　　

27、第7、14和21d，模型組的Runx3蛋白及mRNA的表達(dá)均低于對照組。
　　八、肺組織中Runx3蛋白表達(dá)與肺發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　Runx3蛋白的表達(dá)與RAC、α-SMA陽性的繼發(fā)性肺泡分間隔的百分率正相關(guān)，與肺泡間隔厚度負(fù)相關(guān)。
　　九、Runx3的表達(dá)改變對RLE-6TN細(xì)胞系EMT的影響
　?。ㄒ唬?、RLE-6TN細(xì)胞中Runx3基因沉默及過表達(dá)效果的驗證
　　Western-blotting

28、和Real-time PCR技術(shù)檢測RLE-6TN細(xì)胞Runx3基因沉默及過表達(dá)效果。結(jié)果表明，Runx3基因沉默后48小時，Runx3的蛋白和mRNA的表達(dá)即開始減低，效果持續(xù)72小時;而Runx3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時后，Runx3的mRNA及蛋白的表達(dá)即開始增加，并持續(xù)至轉(zhuǎn)染后的72小時。
　　（二）、各組細(xì)胞EMT標(biāo)志物(SPC、α-SMA)雙標(biāo)免疫熒光結(jié)果
　　對照組和Runx3組RLE-6TN細(xì)胞，可見SPC表達(dá)于細(xì)胞

29、漿，未見α-SMA的表達(dá);TGF-β1組和siRunx3組可出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA的表達(dá);TGF-β1+Runx3組， SPC的表達(dá)類似于對照組，而α-SMA的表達(dá)不明顯。
　?。ㄈ⒏鹘M細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變
　　在TGF-β1和siRunx3組細(xì)胞中，TEM發(fā)現(xiàn)了間質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物actin微絲，而在對照組細(xì)胞、Runx3組、TGF-β1+Runx3組可見正常的AT2的結(jié)構(gòu)。
　　（四）、各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋

30、白及mRNA結(jié)果的檢測
　　1、對照組RLE-6TN細(xì)胞，表達(dá)一定量的SPC和E-cad，而未見α-SMA及N-cad的表達(dá).
　　2、siRunx3組，Runx3沉默72小時的RLE-6TN細(xì)胞，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA及N-cad的表達(dá)，而SPC和E-cad明顯減低，細(xì)胞發(fā)生了EMT。
　　3、Runx3組，Runx3過表達(dá)72小時的RLE-6TN細(xì)胞，SPC和E-cad的表達(dá)無明顯改變，而α-SMA及N-ca

31、d的表達(dá)微量。
　　4、TGF-β1組，與siRunx3組結(jié)果類似，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA及N-cad的表達(dá)，而SPC和E-cad明顯減低。
　　5、TGF-β1+ Runx3組，與對照組結(jié)果類似，可見一定量的SPC和E-cad的表達(dá)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)微量。
　　結(jié)論：
　　1.本研究分別在組織及細(xì)胞水平，證實在BPD發(fā)生、發(fā)展中存在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，表明2型上皮細(xì)胞直接損傷并非影響

32、BPD肺泡化的唯一機制。
　　2.在BPD的肺泡發(fā)育障礙階段，作為轉(zhuǎn)錄因子的Runx3，不論基因還是蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，且其表達(dá)減低的時間恰是發(fā)生EMT的關(guān)鍵時期，并且與肺泡發(fā)育指標(biāo)密切相關(guān)，這說明BPD模型中，Runx3可能通過影響EMT促進(jìn)了BPD的發(fā)生。
　　3.通過建立Runx3基因低表達(dá)和過表達(dá)的細(xì)胞模型，進(jìn)一步驗證了Runx3是調(diào)控EMT的關(guān)鍵基因，從而揭示了BPD中Runx3表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的EMT可能是影響