iNOS在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、目的：
　　人類顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤是嚴(yán)重威脅生命的一種疾病，動(dòng)脈瘤的發(fā)生率在人類為6％。關(guān)于動(dòng)脈瘤的成因有許多假說，如細(xì)胞凋亡假說、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)假說等，但沒有一個(gè)很有說服力的理論形成。所有假說皆認(rèn)為正常動(dòng)脈壁的損傷是動(dòng)脈瘤形成的病理學(xué)基礎(chǔ)。NOS分為神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘發(fā)型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)3種類型。nNOS和eNOS統(tǒng)稱為結(jié)構(gòu)型，主要調(diào)節(jié)生理功能;iNOS主要在病理情況下產(chǎn)生，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程

2、中起重要作用。一氧化氮(NO)可以參與循環(huán)系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的大量病生理過程，NO具有雙重作用，如作為第二信使可以引起血管擴(kuò)張作用，如達(dá)到一定濃度可造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞。動(dòng)脈瘤病理顯示誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)誘導(dǎo)的NO能夠促進(jìn)動(dòng)脈瘤形成還可能通過內(nèi)皮損傷使血管壁的完整性受到破壞從而導(dǎo)致動(dòng)脈瘤的發(fā)生。如果能夠在人類顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)一氧化氮合成酶ONOS)的升高則可以證實(shí)NO對(duì)動(dòng)脈瘤形成的作用。本文通過研究一氧化氮合成酶(iN

3、OS)在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)，探討了NOS對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展及破裂的影響。
　　方法：
　　一、RT-PCR檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中iNOS的mRNA水平
　　取出顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織及顳葉皮層動(dòng)脈血管組織（對(duì)照組）100mg，以美國(guó)Promega總RNA提取試劑盒提取組織總RNA，總RNA提取后以紫外分光光度計(jì)計(jì)算總RNA含量。取4μg總RNA，試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取2μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的變性、退火和延伸

4、溫度分別為:93℃、58℃和72℃，反應(yīng)時(shí)間分別為45s、45s和1min。共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物NOS7.5μl+β-actin7.5μl的cDNA，行15g/L瓊脂糖電泳，凝膠以美國(guó)GDs7600凝膠掃描分析系統(tǒng)行吸光度掃描，計(jì)算出NOS基因表達(dá)量與其相對(duì)β-actin表達(dá)量的比值。
　　二、Western印跡檢測(cè)iNOS在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)
　　取下組織樣本后勻漿制成20％的組織勻漿。測(cè)定蛋白濃度后

5、，按每個(gè)樣本加20ug總蛋白，于不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行蛋白電泳（200 V,電泳1小時(shí)），其溶解膠和積層膠聚丙烯酰胺濃度分別為7.5％和5.0％。電泳完畢后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（100 V,轉(zhuǎn)移1小時(shí)）。轉(zhuǎn)膜后以5％脫脂牛奶（溶于Tris緩沖液）封閉其非特異性結(jié)合位點(diǎn)，繼之將膜置于含有小鼠抗iNOS抗體(1∶2000)的Tris緩沖液中，孵育過夜(4℃)，洗膜后，將膜與羊抗小鼠IgG(1∶1000)抗體孵育，其中羊抗小

6、鼠IgG抗體分子上連接有辣根過氧化物酶，孵育2小時(shí)后，以化學(xué)熒光發(fā)光劑檢測(cè)結(jié)合抗體的密度并進(jìn)行顯影。
　　三、NOS活性的測(cè)定
　　顱動(dòng)脈瘤組和對(duì)照組的組織標(biāo)本均采用生理鹽水勻漿、離心(3000 r/min，10min)制備組織蛋白提取液。離心后的組織蛋白提取液分裝。對(duì)組織蛋白提取液采用Bradford法測(cè)蛋白含量。采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）分別測(cè)量組織標(biāo)本總一氧化氮合酶(total NOS，T-NOS)和誘導(dǎo)型一

7、氧化氮合酶(inducibleNOS，i-NOS)的活性。
　　四、血清NO檢測(cè)
　　取對(duì)照組和顱動(dòng)脈瘤患者髂外動(dòng)脈血2ml置于促凝試管，1h后3000 r/min離心，取上清液-20℃凍存待測(cè)。NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，硝酸還原酶法測(cè)定血清中亞硝酸鹽/硝酸鹽(NO2/NO3)含量以代表NO濃度。所有操作按試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組

8、間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、顱動(dòng)脈瘤中iNOS的mRNA表達(dá)
　　RT-PCR結(jié)果顯示，在對(duì)照組及顱動(dòng)脈瘤組織中均有iNOS mRNA表達(dá)，但是在正常組織中iNOS mRNA的表達(dá)量較少而在顱動(dòng)脈瘤組織中NOS mRNA表達(dá)明顯多于對(duì)照組。
　　二、Western-blot結(jié)果
　　為了進(jìn)一步檢測(cè)NOS在顱動(dòng)脈瘤中的表達(dá)情況，我們使用特異的iNOS抗體進(jìn)行蛋白表

9、達(dá)的檢測(cè)。免疫印跡結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組織中NOS表達(dá)量很低而在顱動(dòng)脈瘤中NOS表達(dá)較對(duì)照組出現(xiàn)明顯增加現(xiàn)象。結(jié)果顯示蛋白表達(dá)同mRNA表達(dá)趨勢(shì)相一致。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　三、T-NOS和i-NOS的活性
　　動(dòng)脈瘤標(biāo)本中i-NOS與T-NOS活性之比為(33.18±4.89)％;正常血管標(biāo)本中i-NOS與T-NOS活性之比為(16.28±4.98)％。兩者相比，相差非常顯著(P＜0.01)四、血清NO檢

10、測(cè)
　　顱動(dòng)脈瘤患者血清NO含量較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05，表1）。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。
　　結(jié)論：
　　本文通過研究一氧化氮合成酶(iNOS)在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)，探討了iNOS對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展及破裂的影響。實(shí)驗(yàn)中采用PCR及Wester-blot方法檢測(cè)腦動(dòng)脈瘤標(biāo)本中一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)了動(dòng)脈瘤標(biāo)本和正常血管標(biāo)本中iNOS活性改變情況。并檢測(cè)了血清中NO的改變。結(jié)果顯示