SP納米緩釋微粒的制備以及對(duì)脾細(xì)胞功能的影響.pdf

1、前言
　　P物質(zhì)(SubstanceP，SP)是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽之一。通過重組DNA技術(shù)研究SP，發(fā)現(xiàn)SP來源于前速激肽原(Pre-Protachykinin，PPT)，因此SP屬于速激肽(Tachykinin，TK)成員。研究發(fā)現(xiàn)SP是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中的重要一員，是神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)共同的化學(xué)語言。
　　NK細(xì)胞屬于大顆粒淋巴細(xì)胞，是天然免疫系統(tǒng)的重要組分。成熟NK細(xì)胞主要聚集于脾臟、肝臟和外周血。研究表明，NK細(xì)胞

2、可通過細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷非己細(xì)胞，并通過釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫。根據(jù)表面標(biāo)志和功能的不同，可以將NK細(xì)胞分為不同的亞群。小鼠NK細(xì)胞庫是由不同表型、功能的NK細(xì)胞亞群組成。CD27與CD11b聯(lián)合可以作為小鼠NK細(xì)胞亞群劃分的依據(jù)，因成熟小鼠NK細(xì)胞高表達(dá)CD11b，因此可將成熟小鼠NK細(xì)胞劃分為CD11bhiCD27hi、CD11bhiCD27lo兩個(gè)亞群。這兩個(gè)細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮著不同

3、的生物學(xué)功能。
　　雖然SP主要通過NK細(xì)胞表面的相應(yīng)神經(jīng)肽受體來介導(dǎo)其生物活性，但這種活化機(jī)制大多局限于體外，體內(nèi)機(jī)制國內(nèi)外研究較少，且缺乏全面系統(tǒng)性，但若將此肽類藥物直接用于臨床試驗(yàn)會(huì)有諸多局限性，如藥物在血漿中的濃度范圍波動(dòng)較大或由于代謝迅速而導(dǎo)致難以達(dá)到有效血藥濃度等。因此，新的藥物輸送系統(tǒng)，在新藥的研發(fā)和應(yīng)用過程中，有越來越重要的地位。納米給藥系統(tǒng)（俗稱藥物納米粒）的出現(xiàn)，為解決這些問題提供了可能。藥物納米粒，是近年來藥

4、劑學(xué)領(lǐng)域研究頗為活躍的一系列新型超微小給藥系統(tǒng)的統(tǒng)稱，其粒徑多在10～500nm之間。由于納米粒子的微小體積和特殊結(jié)構(gòu)，使之在控、緩釋給藥，靶向給藥，黏膜和局部給藥以及基因工程等領(lǐng)域中顯示出特殊的優(yōu)勢(shì)。因此，研制SP的納米粒使SP能在體內(nèi)較長時(shí)間存在，有利于觀察SP對(duì)機(jī)體免疫功能的長期作用，其研究結(jié)果將對(duì)神經(jīng)肽的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　方法
　　1、采用復(fù)乳法制備SP納米粒①精確稱取SP1mg，溶入含0.4％吐溫80

5、的500μl雙蒸水中。②加入到含2.5％聚乳酸(PLGA)的2ml二氯甲烷溶液中，超聲5min使分散形成均一穩(wěn)定的初乳。③將該乳液在超聲條件下加入到8ml2％聚乙二醇(PVA)水溶液中，置于冰水中再分散，形成復(fù)乳。④將該復(fù)乳液室溫下磁力攪拌3h使有機(jī)溶劑揮發(fā)，得膠體混懸液。將該膠體液以10000轉(zhuǎn)/min，冷凍離心三次，每次10min，沉淀物真空凍干燥得凍干粉，密封后置于4℃保存，即得SP納米微粒。
　　2、SP納米粒的穩(wěn)定性質(zhì)研

6、究取適量SP納米粒凍干粉超聲分散于無水乙醇中，透射電鏡下觀察微粒形態(tài)和大小。同時(shí)測(cè)量微粒的平均粒徑。制備3批SP納米粒，常規(guī)考察其色澤外觀及再分散情況。將SP納米粒凍干粉置于4℃冰箱中，3個(gè)月后取出再分散于生理鹽水中，觀察乳狀液的各項(xiàng)指標(biāo)，了解其穩(wěn)定性。
　　3、SP納米粒載藥率、包裹率的測(cè)定新制備的混懸膠體液冷凍離心后收集上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定上清液中SP的含量，從而得出未被包裹的SP量，進(jìn)而計(jì)算SP納米粒的載藥率和包裹

7、率。
　　4、SP納米粒的體外釋藥試驗(yàn)精密稱取含2μg的SP納米粒置于離心管中，每個(gè)離心管中加入生理鹽水至1ml，再置于4℃水浴箱中恒溫震蕩。按1、2、4、8、12、24、36h定時(shí)取樣，以ELISA試劑盒測(cè)定不同時(shí)點(diǎn)的上清液中SP濃度，取樣后加入生理鹽水恢復(fù)原體積。
　　5、SP納米粒的體內(nèi)釋藥試驗(yàn)取C57BL/6純系小鼠，分PBS組、空白顆粒組、SP組、SP納米粒四組。肌肉注射后，在5、10、15、20、25min各時(shí)間

8、點(diǎn)，每組選3只小鼠眼球取血，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清中SP濃度。
　　6、CCK8法檢測(cè)SP對(duì)小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性。
　　7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SP對(duì)小鼠脾細(xì)胞功能的影響。
　　8、Real-TimePCR法檢測(cè)SP對(duì)小鼠脾細(xì)胞殺傷介質(zhì)（穿孔素、顆粒酶B）和活化受體(NKG2D、NKp46)的mRNA表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、SP納米粒的一般性質(zhì)。
　　SP納米粒膠體懸液混懸透明。透射電鏡

9、下，該納米粒表面光滑，均勻度好，粒徑分布均勻，平均粒徑50nm。凍干粉為白色疏松粉末。4℃下放置3個(gè)月后，凍干粉的再分散性良好，在生理鹽水中分布呈混懸膠體狀，無沉淀，表明SP納米粒的穩(wěn)定性及再分散性良好。
　　2、SP納米粒的平均載藥率為1.11％±0.036，平均包裹率為84.37％±3.56。
　　3、SP納米粒的體外釋藥試驗(yàn):SP納米粒在36h內(nèi)能一直持續(xù)釋放SP，說明SP具有明顯的緩釋效果。
　　4、SP納米粒

10、的體內(nèi)釋藥試驗(yàn)
　　與對(duì)照組相比，空白顆粒組血清中SP含量在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)變化不大，SP組和SP納米粒組在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)血清中SP含量差異顯著。其中，SP組在第15min時(shí)的血清中SP含量達(dá)到最大值，此后量值呈下降趨勢(shì);SP納米粒組在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的血清SP含量呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)。
　　5、與對(duì)照組相比，空白顆粒組中小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性沒有明顯差異，其余各組均有明顯差異。其中，SP組的中劑量部分較高、低劑量部分的殺傷活性高;納米高劑量組較納

11、米中、低劑量組的殺傷活性高。
　　6、各組藥物連續(xù)5天免疫小鼠后，F(xiàn)CAS檢測(cè)結(jié)果表明，SP組（低、中、高濃度）和納米組（低、中、高濃度）均可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞CD27的表達(dá)率。其中，脾臟中的SP低劑量組和納米粒低劑量組對(duì)CD27的影響顯著。
　　7、SP組（低、中、高濃度）和納米組（低、中、高濃度）均可顯著提高小鼠脾細(xì)胞殺傷介質(zhì)（穿孔素、顆粒酶B）和活化受體(NKG2D、NKp46)的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)論

12、　　1、SP納米粒具有易于合成、質(zhì)量穩(wěn)定、降解速度可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)乳法制備SP納米粒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SP納米粒球體均勻度好，凍干粉為白色疏松粉末，再分散性良好。
　　2、本研究測(cè)定了3批次SP納米粒的載藥率和包裹率，結(jié)果均相差不大，表明制備工藝有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
　　3、SP納米粒的體內(nèi)、外釋藥試驗(yàn)說明SP具有明顯的緩釋效果。
　　4、一定濃度的SP可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性，并能提高小鼠脾細(xì)胞殺傷介質(zhì)