負(fù)載HBx抗原的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性抗肝癌效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　制備由HBx抗原負(fù)載的DC疫苗,檢測(cè)其在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型體內(nèi)的抗腫瘤作用,為肝癌的生物免疫治療提供新的改良方式和科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx蛋白HepG2人肝癌細(xì)胞系的鑒定及培養(yǎng):利用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx蛋白的HepG2人肝癌細(xì)胞系中HBx蛋白的表達(dá);確定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的G418篩選濃度。
　　2.人免疫重建裸鼠模型的建立及鑒定:將無(wú)免

2、疫滲漏的12只裸鼠隨機(jī)分為2組:腹腔注射人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞6只作為人免疫重建組,腹腔注射無(wú)菌PBS6只作為空白對(duì)照組。觀(guān)察小鼠生物學(xué)特征;ELISA檢測(cè)小鼠外周血人IgG含量;HE染色法檢測(cè)小鼠肝脾組織中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　3.HBx抗原負(fù)載的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌模型體內(nèi)的抗腫瘤作用觀(guān)察:在體外培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-4和TNF-α)誘導(dǎo)分化出DC細(xì)胞,將HBx抗原負(fù)載制備DC疫

3、苗,在15只人免疫重建24h后的裸鼠的右前腋下接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx蛋白HepG2人肝癌細(xì)胞,建立人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型;裸鼠皮下移植瘤種植后的第7天將其隨機(jī)分為3組進(jìn)行治療:HBx-DC組,5只,每只腹腔注射HBx抗原致敏的DC疫苗2x105/0.2ml;DC組,5只,每只腹腔注射DC2x105/0.2ml;對(duì)照組,5只,每只腹腔注射生理鹽水0.2ml。觀(guān)察小鼠的一般情況及腫瘤組織的生長(zhǎng)情況;ELISA法檢測(cè)小鼠血清中TH1、TH2類(lèi)

4、細(xì)胞因子表達(dá);PI染色法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞周期改變,計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù);病理學(xué)觀(guān)察腫瘤組織病理情況;免疫組織化學(xué)檢測(cè)相關(guān)因子P53、Bax、Casepas-3、Bcl-2、VEGF、CD34、MMP-2、CDK2、MMP-9、、P21表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系中HBx示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx組,HBx mRNA的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組及空載體組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western b

5、lot細(xì)胞系中HBx蛋白表達(dá)水平示:分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同劑量的HBx蛋白的HepG2細(xì)胞,其HBx蛋白表達(dá)水平均低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀(guān)察2周后發(fā)現(xiàn),600μg/ml即能使細(xì)胞漂浮死亡,即該細(xì)胞系篩選濃度。
　　2.12只人免疫重建裸鼠在9周內(nèi)無(wú)死亡,未觀(guān)察到移植物抗宿主反應(yīng)出現(xiàn)。分別于注射后的第2、4、6、8周,使用ELISA法檢測(cè)Balb/c裸鼠外周血中人IgG含量發(fā)現(xiàn),人免疫重建組小鼠外周血

6、人lgG含量隨著時(shí)間的推移逐漸升高,且各時(shí)間點(diǎn)間人lgG含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組相比,人免疫重建組在相同時(shí)間點(diǎn)人lgG含量均明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HE染色檢測(cè)小鼠肝脾組織發(fā)現(xiàn):人免疫重建組裸鼠脾臟組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),人免疫重建組裸鼠肝臟組織以及對(duì)照組裸鼠肝、脾組織,均未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　3.HBx-DC組、DC組小鼠精神狀態(tài)較好,對(duì)照組小鼠精神萎靡,局部腫瘤組織出現(xiàn)潰破。HBx-

7、DC組小鼠的皮下移植瘤增長(zhǎng)速度明顯減慢,差異在一周后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第六周將裸鼠處死取腫瘤組織稱(chēng)重,發(fā)現(xiàn)HBx-DC組瘤重明顯低于其他兩組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),瘤種抑瘤率為0.6。治療的第5周,ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與其他兩組比較,HBx-DC組Th1類(lèi)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯上升,Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10明顯下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HBx-D

8、C組腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于其他兩組(P<0.05)。病理學(xué)證實(shí)腫瘤為有HBx表達(dá)的人肝癌,且HBx-DC組腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞出血、壞死,有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化發(fā)現(xiàn)HBx-DC組P53、Bax、Casepas-3、P21的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),Bcl-2、VEGF、CD34、MMP-2、MMP-9的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.HBx蛋白的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了影響。