HCV多表位基因重組BCG活疫苗的構(gòu)建及在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)是慢性肝炎、肝硬化等慢性肝病的主要致病因子之一，HCV急性感染后55～85％以上發(fā)展為慢性肝炎，其中約20％最終結(jié)局為肝硬化、肝細胞腫瘤或肝功能衰竭。世界范圍內(nèi)大約有1.7億患者，我國感染人數(shù)大約為5000萬，并有上升的趨勢。目前對HCV感染的治療除了重組α干擾素(INF-α)有一定療效外，仍無切實有效的抗病毒治療方法，亟需發(fā)展有效的預(yù)防性和治療性疫苗以防止其傳播。目前HCV疫苗的研

2、究主要集中在核酸疫苗、亞單位疫苗和病毒載體疫苗等方面，其共同不足是不能刺激理想的細胞免疫應(yīng)答。而由于HCV包膜糖蛋白E2的中和性抗原位點存在高變區(qū)(hypervariableregion，HVR)，使體液免疫為主的HCV預(yù)防性疫苗研究長期以來進展緩慢。因此，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向以細胞免疫為主的預(yù)防和治療性疫苗方面。 本研究利用基因重組技術(shù)，把含HCV截短C基因、E2區(qū)模擬表位和非結(jié)構(gòu)區(qū)的多個Th與CTL(主要為A2限制性)表位基因

3、串聯(lián)，多表位基因構(gòu)建入大腸桿菌和分枝桿菌穿梭質(zhì)粒，篩選分泌表達HCV多表位抗原的重組BCG(recombinantBCG,rBCG)，然后免疫BALB/c小鼠及HLA-2限制性的HHD-2轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測其細胞與體液免疫應(yīng)答，評價該重組BCG活疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，以期為HCV新型疫苗的研制開發(fā)提供新的實驗依據(jù)。 1.HCV多表位抗原CtEm的克隆表達及免疫學(xué)特性分析設(shè)計引物，以HCV-H株全長cDNA序列為模板，PCR擴增獲得C

4、區(qū)羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成拼接E區(qū)模擬表位和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3、NS4、NS5的七個優(yōu)勢表位基因Em，分別克隆入大腸桿菌和分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pDE22。將測序正確的CtEm基因克隆入原核表達載體pQE30并誘導(dǎo)表達。以HCV患者陽性血清對表達產(chǎn)物進行Western-blot分析，結(jié)果顯示在相對分子量約36kD處有預(yù)計大小的特異性條帶，表明成功表達出融合蛋白。采用Ni2+-NTA親和柱獲得了純化的融合蛋白。經(jīng)此純化的融合蛋白免疫的小鼠

5、能產(chǎn)生特異性抗體，其滴度達到1∶1280;純化的融合蛋白能與86.7％的HCV患者血清抗體反應(yīng)，顯示其良好的免疫原性和抗原性。 為了評價多表位抗原CtEm在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答，我們建立了能穩(wěn)定表達CtEm融合蛋白的P815細胞克隆。將CtEm基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-)，構(gòu)建了CtEm融合蛋白的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-CtEm。在陽離子聚合物作用下重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與BALB/c小鼠

6、遺傳背景一致的P815(H-2d)細胞，通過G418壓力篩選后，得到2株陽性細胞克隆。經(jīng)過RT-PCR檢測融合蛋白mRNA表達，用間接免疫熒光可以在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的P815細胞胞內(nèi)檢測到較強的綠色熒光，證實P815細胞內(nèi)有融合蛋白的表達。 2.HCV多表位基因的DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)特性研究將CtEm克隆入真核表達載體pcDNA3.1(-)，構(gòu)建HCV多表位基因的真核表達載體pcDNA3.1(-)-CtEm，脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染CH

7、O細胞，觀察其表達情況；大量提取質(zhì)粒，以100μg重組質(zhì)粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠，共免疫三次，觀察其體液免疫和細胞免疫效果。結(jié)果多表位基因在體外獲得了有效表達，該質(zhì)粒肌注免疫BALB/c小鼠，可誘生特異性的抗體，6～8周達到高峰。分離免疫小鼠的脾淋巴細胞，體外用CtEm融合蛋白刺激，MTT法檢測淋巴細胞增殖反應(yīng)。結(jié)果基因疫苗誘導(dǎo)淋巴細胞增殖刺激指數(shù)為2.6，高于空載體對照組的1.9(P＜0.05)和生理鹽水對照的0.8(P＜0.

8、01)?；蛞呙缯T導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ為892±19pg/mL，顯著高于空載體對照組的383±12pg/mL(P＜0.01)和生理鹽水組的192±11pg/mL(P＜0.01)。以穩(wěn)定表達CtEm融合蛋白的P815細胞為靶細胞，觀察重組基因疫苗接種小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL殺傷效應(yīng)，結(jié)果重組基因疫苗組在效靶比為100∶1時的CTL殺傷效應(yīng)為43.2％，顯著高于空載體對照組的29.2％(P＜0.05)和生理鹽水對照組的10.1％(P＜0.01)

9、。證實多表位基因DNA免疫可誘生特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。但基因免疫也存在抗體滴度低、維持時間較短，細胞免疫應(yīng)答較弱等缺點。 3.表達多表位抗原的重組BCG的篩選及在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答研究 構(gòu)建分泌表達型穿梭表達載體pDE22-CtEm。將純化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入BCG，經(jīng)潮霉素抗性篩選和PCR方法鑒定出含目的基因的重組BCG陽性克隆。將含目的基因的重組BCG大量培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，濃縮后經(jīng)SDS-PA

10、GE和Western-blot分析，確定CtEm蛋白在BCG中的融合表達。 用CtEm重組基因疫苗和重組BCG疫苗分別接種BALB/c小鼠，以研究這兩種重組疫苗的免疫學(xué)特性。同時設(shè)立BCG、生理鹽水對照組。結(jié)果重組BCG所誘導(dǎo)的抗體水平高于基因免疫組(P＜0.05)，且維持時間較長。分離免疫小鼠的脾淋巴細胞，體外用CtEm融合蛋白刺激，以MTT法檢測淋巴細胞增殖反應(yīng)。結(jié)果重組BCG接種后小鼠淋巴細胞增殖刺激指數(shù)為2.8，略高于基

11、因疫苗免疫組的2.4，而顯著高于普通BCG免疫組的1.6和生理鹽水對照組的0.8(P＜0.01)。另外，普通BCG免疫組較生理鹽水對照組有顯著差異(P＜0.01)，也說明BCG自身作為一種佐劑，能引起淋巴細胞增殖。重組BCG疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ為1196±15pg/mL，高于重組基因疫苗組的870±13pg/mL(P＜0.05)，并顯著高于普通BCG免疫組的506±12pg/mL(P＜0.01)。以穩(wěn)定表達CtEm融合蛋白的P815

12、細胞為靶細胞，觀察這兩種重組疫苗接種小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL殺傷效應(yīng)，結(jié)果在效靶比為100∶1時重組BCG所誘導(dǎo)的CTL殺傷效應(yīng)為52.6％，略高于基因疫苗組的43.2％，而顯著高于普通BCG免疫組的22.8％(P＜0.01)。以上結(jié)果提示重組BCG誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答高于基因免疫。 4.表達多表位抗原的重組BCG疫苗的在HHD-2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答研究 用表達CtEm融合蛋白的重組BCG疫苗腹部皮下接種HHD-2

13、轉(zhuǎn)基因小鼠，同時設(shè)立普通BCG免疫組、生理鹽水對照組。結(jié)果表明，重組BCG可誘導(dǎo)較高水平的抗體，加強免疫后抗體水平進一步升高，且維持時間較長。分離免疫小鼠的脾淋巴細胞，體外用CtEm融合蛋白刺激，以MTT法檢測淋巴細胞增殖反應(yīng)。結(jié)果重組BCG接種后小鼠淋巴細胞增殖刺激指數(shù)為3.8，顯著高于普通BCG免疫組的1.8(P＜0.01)和生理鹽水組的0.9(P＜0.01)；重組BCG疫苗誘導(dǎo)的IFN-γ為1269±11pg/mL，顯著高于BCG

14、免疫組的521±16pg/mL和生理鹽水組的192±18pg/mL(P＜0.01)。以CtEm蛋白共孵育的C1R-AAD細胞為靶細胞，觀察重組疫苗接種轉(zhuǎn)基因小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL殺傷效應(yīng)，結(jié)果在效靶比為100∶1時重組BCG所誘導(dǎo)的CTL殺傷效應(yīng)為65.3％，顯著高于普通BCG組的22.8％(P＜0.01)，也略高于重組BCG免疫BALB/c小鼠的52.6％。從而提示HLA-A2限制性的表位抗原能在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)被有效呈遞，誘發(fā)表位特異