宮頸癌HeLa細(xì)胞分泌的PGE2抑制巨噬細(xì)胞RAW中CCL5產(chǎn)生的機(jī)制研究.pdf

1、目的:宮頸癌是國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，且發(fā)病有逐年上升和年輕化的趨勢(shì)。研究顯示，炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，由于腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性因素的存在，如前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，使得許多炎癥因子無(wú)法正常發(fā)揮作用，反而起到促瘤作用。為進(jìn)一步研究宮頸癌患者中炎癥與腫瘤的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞收集的上清液作為腫瘤條件培養(yǎng)基(tumorconditioned medium

2、，TCM)，觀察TCM是否會(huì)抑制巨噬細(xì)胞RAW中調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌的趨化因子(regulated upon activationnormal T cell expressed and secreted，RANTES/CCL5)的產(chǎn)生，這種抑制效應(yīng)是否由腫瘤條件培養(yǎng)基中的PGE2產(chǎn)生，并探討宮頸癌HeLa細(xì)胞分泌的PGE2對(duì)巨噬細(xì)胞中CCL5產(chǎn)生的這種抑制效應(yīng)的機(jī)制，為宮頸癌的臨床治療提供新的思路。
　　方法:
　　

3、1.制備腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM):完全培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為0.6×106/ml的HeLa細(xì)胞，72小時(shí)后收集上清，0.45μm濾器過(guò)濾，-20℃保存，備用，即為T(mén)CM。
　　2.培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW，用不同劑量（0，200，400，600μl）的TCM及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)（1μg/ml）刺激RAW，觀察巨噬細(xì)胞RAW中CCL5蛋白和mRNA表達(dá)。
　　3.使用不同劑量(0，10-13

4、，10-12，10-11，10-10M)的PGE2及LPS(1μg/ml)刺激巨噬細(xì)胞RAW，觀察CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　4.使用抑制劑NS-398抑制PGE2的合成后觀察巨噬細(xì)胞RAW CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)情況。
　　5.使用PGE2的受體拮抗劑:10μM SC51322（EP1的拮抗劑），3μMAH6809（EP2的拮抗劑）和30μM AH23848（EP4的拮抗劑）及AH6809+AH23848觀察

5、巨噬細(xì)胞的CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.使用不同劑量的TCM與LPS（1μg/ml）刺激巨噬細(xì)胞RAW后，巨噬細(xì)胞內(nèi)CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)均會(huì)下降，且這種作用具有劑量依賴性。LPS刺激前后，CCL5的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LPS+TCM共刺激與LPS單獨(dú)刺激相比，CCL5的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.用不同劑量的PGE2及LPS（1μg/ml）刺激巨噬

6、細(xì)胞RAW，CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)均會(huì)下降。PGE2的不同劑量組與LPS單獨(dú)刺激相比，CCL5的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.用PGE2的抑制劑NS-398加入HeLa中制備TCM，用后者刺激巨噬細(xì)胞RAW后，CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)抑制被逆轉(zhuǎn)，提示PEG2是TCM的重要成分，且其在CCL5的表達(dá)上發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　4.用PGE2的受體拮抗劑:10μM SC51322（EP1的拮抗

7、劑），3μMAH6809（EP2的拮抗劑），30μM AH23848（EP4的拮抗劑）及AH6809+AH23848刺激巨噬細(xì)胞RAW觀察CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)情況:SC51322對(duì)CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)無(wú)影響;AH6809和AH23848均會(huì)部分逆轉(zhuǎn)PGE2對(duì)CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)的抑制效應(yīng);聯(lián)合AH6809+AH23848則會(huì)完全逆轉(zhuǎn)PGE2對(duì)CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)的抑制效應(yīng)。Med（培養(yǎng)基，medium）與

8、LPS、LPS與LPS+TCM、LPS+TCM與LPS+TCM+AH6809、LPS+TCM與LPS+TCM+AH23848、LPS+TCM與LPS+TCM+AH6809+AH23848相比，CCL5的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　腫瘤條件培養(yǎng)基TCM即培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞制備所得，抑制巨噬細(xì)胞RAW中CCL5蛋白和mRNA的表達(dá)。根據(jù)研究這種抑制效應(yīng)是由PGE2產(chǎn)生，在實(shí)驗(yàn)中使用不同劑量的PG