肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的： 1.復(fù)制具有病證結(jié)合特點(diǎn)的高血壓肝陽(yáng)上亢證與出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證動(dòng)物模型。 2.研究肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證垂體、腎上腺、甲狀腺及脾淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律，從神經(jīng)內(nèi)分泌.免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平探討二證本質(zhì)內(nèi)涵，為肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證開(kāi)辟新的研究領(lǐng)域。 3.尋找肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證相同與差異表達(dá)的蛋白，揭示同病異證和異病同證的本質(zhì)內(nèi)涵。 方法： 1.高血壓肝陽(yáng)上亢

2、證動(dòng)物模型的復(fù)制：75只SD大鼠隨機(jī)分為正常組15只（自由飲水），高血壓肝陽(yáng)上亢證組60只，采用附子湯灌胃（附子湯的劑量為20 ml/kg-d），同時(shí)喂1.5％高滲鹽水的方法，共6周，6周后從激惹程度、結(jié)膜充血情況、血壓測(cè)定及旋轉(zhuǎn)時(shí)間等方面進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。 2.出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證動(dòng)物模型的復(fù)制：在成功復(fù)制高血壓肝陽(yáng)上亢證模型基礎(chǔ)上，采用Ⅶ膠原酶腦內(nèi)定位注射誘導(dǎo)大鼠腦出血復(fù)制成出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證模型，從行為學(xué)與形態(tài)學(xué)觀察評(píng)價(jià)模型

3、成功與否。 3.缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證動(dòng)物模型的復(fù)制：在成功復(fù)制高血壓肝陽(yáng)上亢證模型基礎(chǔ)上，用改良線栓法造成大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），復(fù)制成缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證模型，從行為學(xué)與TTC染色評(píng)價(jià)模型成功與否。 4.蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)及基因、蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證：應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）分別

4、分離各組垂體、腎上腺、甲狀腺及脾淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)，改良的考馬斯亮藍(lán)染色使凝膠中的蛋白質(zhì)點(diǎn)可視化；掃描凝膠成像，Pdquest圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析并識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與共同表達(dá)的蛋白質(zhì)；應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜（pe

5、ptide mass fingerprint，PMF），搜索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定，運(yùn)用RT-PCR與western blotting方法從基因與蛋白質(zhì)兩方面驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白。 結(jié)果： 1.動(dòng)物模型的復(fù)制：60只SD大鼠成功復(fù)制成高血壓肝陽(yáng)上亢證模型48只，模型成功率為80％；模型成功后隨機(jī)分為高血壓肝陽(yáng)上亢組14只，出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)組17只（實(shí)驗(yàn)中死亡2只）和缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)組17只（實(shí)驗(yàn)中死亡3只）。 2.動(dòng)物模

6、型的評(píng)價(jià)：①高血壓肝陽(yáng)上亢證組大鼠出現(xiàn)不同程度的性情變化，表現(xiàn)為煩躁、易激惹、互相打斗，部分大鼠雙眼結(jié)合膜顏色加深變紅，與正常組比較差異有顯著性（P<0.05）；與正常組相比旋轉(zhuǎn)時(shí)間明顯縮短（P<0.05）；隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，血壓逐步上升，至第6周達(dá)到高峰，與正常組比較差異有顯著性（P<0.01）；②造模術(shù)后12h出血性肝陽(yáng)化風(fēng)證組與缺血性肝陽(yáng)化風(fēng)證組大部份出現(xiàn)了結(jié)膜充血，且其易激惹程度進(jìn)一步加重，表現(xiàn)為提尾時(shí)尖叫、驚跳，甚至咬人或同籠大

7、鼠頻繁打斗，與正常組、肝陽(yáng)上亢組比較差異有顯著性意義（P<0.05）；旋轉(zhuǎn)時(shí)間較術(shù)前更加縮短，且血壓進(jìn)一步上升，與正常組、肝陽(yáng)上亢證組比較差異有顯著性（均P<0.05）；腦出血術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分>2分的為13只；腦缺血術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分>2分的為12只：出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證HE染色示腦內(nèi)形成直徑3mm左右血腫，光鏡下見(jiàn)出血灶內(nèi)充滿變性紅細(xì)胞、大量中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)正常結(jié)構(gòu)，血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證TT

8、C染色示缺血區(qū)腦組織顏色蒼白，其余部分染色為均勻紅色，缺血的大鼠腦缺血體積百分比為（15-45％），正常組全腦染色為均勻紅色。 3.垂體、腎上腺、甲狀腺組織及脾淋巴細(xì)胞雙向凝膠電泳圖譜的建立和圖象分析：在相同條件下分別對(duì)垂體、腎上腺、甲狀腺及脾淋巴細(xì)胞總蛋白質(zhì)各進(jìn)行了3次雙向凝膠電泳分離，考染顯色后得到背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的2-DE圖譜各3塊，其總蛋白質(zhì)的分布模式非常相似，使用PDQuest軟件對(duì)凝膠圖譜進(jìn)行圖像分析結(jié)果

9、顯示，垂體組織的2-DE圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)約1100±32個(gè)；腎上腺的2-DE圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)約800±56個(gè)；甲狀腺的2-DE圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)約500±17個(gè)；脾淋巴細(xì)胞的2-DE圖譜約的蛋白質(zhì)點(diǎn)約1200±24個(gè)，大多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)在位置和豐度上是一致的，主要分布在pH4-8和Mr20-60kD的范圍內(nèi)。 4.選取四組中差異表達(dá)和共同表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)作進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定，從匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中隨機(jī)選取了61個(gè)分辨較清楚的點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TO

10、F-MS分析，共有46個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定，根據(jù)NCBI、MSDB數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的的信息，這些差異蛋白質(zhì)的功能涉及抗氧化應(yīng)激、代謝相關(guān)酶、蛋白質(zhì)合成與降解、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、分子伴侶、出凝血相關(guān)等，其中類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）、泛素C末端水解酶L1（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1，UC

11、H-L1）、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2（Dihydropyrimidinase-related protein2，DRP-2）、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（Peroxiredoxin，PRDX）等可能與肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的相互作用有關(guān)。 5.差異蛋白驗(yàn)證結(jié)果： （1）RT-PCR結(jié)果顯示：STARmRNA、DRP-2mRNA及PRDX2mRNA在高血壓肝陽(yáng)上亢證、出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表

12、達(dá)均較正常組明顯增強(qiáng)（p<0.01），而在出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)又較高血壓肝陽(yáng)上亢證組表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證兩組間比較比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；UCH-L1mRNA在高血壓肝陽(yáng)上亢證、出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)均較正常組明顯減弱（p<0.01），而在出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)又較高血壓肝陽(yáng)上亢證組表達(dá)明顯減弱（P<0

13、.05），出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證兩組間比較無(wú)明顯差異（P>0.05），且STARmRNA、DRP-2mRNA、PRDX2mRNA及UCH-L1mRNA在垂體與腎上腺中的表達(dá)水平一致。 （2）Western blotting結(jié)果顯示：STAR在高血壓肝陽(yáng)上亢證、出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)均較正常組明顯增強(qiáng)（p<0.01），而在出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)又較高血壓肝陽(yáng)上

14、亢證組表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組兩組間比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；UCH-L1在高血壓肝陽(yáng)上亢證、出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)均較正常組明顯減弱（p<0.01），而在出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組表達(dá)又較高血壓肝陽(yáng)上亢證組表達(dá)明顯減弱（P<0.01），出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證組兩組間比較無(wú)明顯差異（P>0.05），結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)及RT-

15、PCR研究的結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.成功復(fù)制了高血壓肝陽(yáng)上亢證、出血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證及缺血性中風(fēng)肝陽(yáng)化風(fēng)證動(dòng)物模型，具有病證結(jié)合的特點(diǎn)。 2.肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證的形成過(guò)程是一個(gè)多蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜病理過(guò)程，且神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的多個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了明顯的改變，提示二證神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)了明顯的紊亂。 3.肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證既有相同的蛋白質(zhì)表達(dá)又有差異的蛋白質(zhì)表達(dá)，提示二證既有相同的物質(zhì)基