多腫瘤標(biāo)志物診斷模式的建立和新型電化學(xué)免疫傳感器的研制.pdf

1、世界衛(wèi)生組織指出,如能早期診斷并及時治療,95％的腫瘤可以治愈。腫瘤標(biāo)志物在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實(shí)用價值。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)(包括蛋白質(zhì)組、ELISA、RT-PCR、FISH和SELDI-TOF等)的飛速發(fā)展,發(fā)現(xiàn)了許多有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物。目前臨床應(yīng)用的標(biāo)志物達(dá)到20左右,但因單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物敏感度和特異度較低,無法準(zhǔn)確診斷腫瘤和預(yù)測預(yù)后。國內(nèi)外研究表明,多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合動態(tài)檢測是提高腫

2、瘤診斷可行性策略。目前臨床上常用的多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(C-12蛋白芯片),含有12種(糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9,CA19-9),神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specificenolase,NSE),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),糖類抗原242(carbohydrateantigen242,CA242),糖類抗原125(carbohydrate

3、 antigen125,CA125),糖類抗原15-3(carbohydrate antigen153,CA15-3),甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP),鐵蛋白(Ferritin,Fer),游離型前列腺特異性抗原(free prostate specific antigen,F-PSA),前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA),生長激素(human growth hormon

4、e,HGH)及絨毛膜促性腺激素β(β-HCG)等12種腫瘤標(biāo)志物,涵蓋了大約10種常見的惡性腫瘤,適用于健康人群的體檢、篩查及進(jìn)行腫瘤的輔助診斷。但在具體應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)C-12蛋白芯片具有診斷靈敏度低、特異度低、分析困難、無法準(zhǔn)確定位等缺點(diǎn),限制其臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。
　　 發(fā)展高靈敏的免疫分析技術(shù)對于腫瘤標(biāo)志物的檢測有著至關(guān)重要的意義。電化學(xué)免疫傳感器利用抗原和抗體間的高度特異性結(jié)合,將免疫分析法和電化學(xué)傳感器相結(jié)合,該傳感器具

5、有靈敏度高,分析速度快,操作簡便、價格低廉及選擇性好等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。納米生物技術(shù)是納米技術(shù)與生物技術(shù)交叉滲透形成的新技術(shù),是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重要發(fā)展方向。納米粒子具有優(yōu)良的電學(xué)、磁學(xué)、光學(xué)性質(zhì)以及優(yōu)越的生物相容性,可用于固定抗體,在免疫分析中已得到廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)今,免疫分析法和免疫傳感器的研制成為檢測腫瘤標(biāo)志物的研究新興技術(shù)。大量研究用于研發(fā)操作簡便易行的傳感器。盡管這個領(lǐng)域的技術(shù)具有不少優(yōu)點(diǎn),但是尋求一種更加簡便,

6、靈敏度更高,選擇性更好的免疫方法仍然是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 本研究用C-12蛋白芯片法檢測2177例惡性腫瘤患者(肺癌836例,肝癌318例,胰腺癌84例,胃癌123例,腸癌338例,乳腺癌206例,卵巢癌47例,子宮內(nèi)膜癌28例,食管癌197例)和2111例正常及良性疾病的非腫瘤患者的12項(xiàng)常見腫瘤標(biāo)志物,并結(jié)合臨床資料進(jìn)行回顧性研究。進(jìn)而應(yīng)用Bayes法建立腫瘤判別診斷函數(shù),提高C-12蛋白芯片對

7、腫瘤診斷的準(zhǔn)確率并探討多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)對惡性腫瘤診斷的臨床意義。采用HTA、結(jié)合Vbscript及Javascript語言編程,研制《多蛋白芯片腫瘤判別》軟件。同時將納米技術(shù)、生物傳感技術(shù)和電化學(xué)分析技術(shù)結(jié)合用于免疫分析。應(yīng)用納米二氧化硅顆粒、納米金包裹石墨烯納米復(fù)合物、PB-SiO2納米復(fù)合物和包裹了抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)的脂質(zhì)體等納米材料,采用不同方法構(gòu)建功能化生物分子固定界面,制備了一系列高靈敏的電化學(xué)免疫傳感

8、器。研究目的
　　 1.探討多腫瘤標(biāo)志物在10種常見腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義。
　　 2.通過Bayes法建立多腫瘤標(biāo)志物判別函數(shù),以明確腫瘤類型,提高腫瘤診斷準(zhǔn)確率,比較多腫瘤標(biāo)志物判別函數(shù)與C-12多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)的差異和對腫瘤診斷的臨床意義。進(jìn)而研制基于多腫瘤蛋白芯片檢測結(jié)果的腫瘤判別工具軟件系統(tǒng)。
　　 3.將IgG抗體標(biāo)記到辣根過氧化物酶(HRP)摻雜二氧化硅納米顆粒表面(anti-IgG-

9、SiO2-HRP),建立一種簡單又靈敏的電化學(xué)免疫分析方法檢測人血清中IgG的水平。
　　 4.制備納米金包裹的石墨烯納米復(fù)合物(NGGN)標(biāo)記二抗,基于夾心免疫分析模式,建立一種新型高靈敏電化學(xué)免疫免疫傳感器,用于檢測血清中癌胚抗原(CEA)含量。
　　 5.使用PB-SiO2復(fù)合納米粒子,殼聚糖-金納米粒子復(fù)合物(CS-nanoAu)制備檢測小細(xì)胞肺癌的性能優(yōu)良的新型電化學(xué)免疫傳感器。
　　 6.采用分別包裹

10、了抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)的脂質(zhì)體作為信號放大的載體,構(gòu)建了一種可同時檢測小細(xì)胞肺癌血清標(biāo)志物ProGRP和NSE的生物傳感技術(shù)。
　　 研究內(nèi)容和方法
　　 1.多腫瘤標(biāo)志物在惡性腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義
　　 用蛋白芯片法檢測2177例惡性腫瘤患者(肺癌836例,肝癌318例,胰腺癌84例,胃癌123例,腸癌338例,乳腺癌206例,卵巢癌47例,子宮內(nèi)膜癌28例,食管癌197例)和2111例正常及患良

11、性疾病的非腫瘤患者的12項(xiàng)常見腫瘤標(biāo)志物,并結(jié)合臨床資料進(jìn)行回顧性研究。建立腫瘤蛋白芯片數(shù)據(jù)庫和臨床數(shù)據(jù)庫。進(jìn)而分析各腫瘤標(biāo)志物在常見十種腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義。
　　 2.多腫瘤標(biāo)志物判別函數(shù)的建立及診斷軟件的研制
　　 應(yīng)用Bayes法建立腫瘤判別診斷函數(shù),比較12種腫瘤標(biāo)志物和判別診斷函數(shù)對腫瘤診斷的準(zhǔn)確率差異。并采用HTA、結(jié)合Vbscript及Javascript語言編程。
　　 3.雙重標(biāo)記納米二氧

12、化硅顆粒電化學(xué)免疫傳感器檢測血清中IgG
　　 合成HRP摻雜納米二氧化硅,然后將IgG抗體鍵合到納米二氧化硅的表面,制得anti-IgG-SiO2-HRP并作為檢測抗體,使用央心免疫分析方法,在酶底物過氧化氫存在的條件下,免疫反應(yīng)前后電流的變化與抗原的濃度成正比。
　　 4.新型納米金包裹石墨烯納米復(fù)合物檢測癌胚抗原高靈敏電化學(xué)免疫傳感器的研究。
　　 電沉積普魯士藍(lán)修飾玻碳電極,并在其表面電沉積一層納米金,固

13、載癌胚抗體蛋白。制備辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)的二抗標(biāo)記的NGGN顆粒,利用夾心免疫分析方法實(shí)現(xiàn)對癌胚抗原的高靈敏檢測。
　　 5.基于PB-SiO2納米復(fù)合物的信號增強(qiáng)的免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于檢測神經(jīng)化烯醇酶(NSE)
　　 利用層層自組裝技術(shù)將PB-SiO2復(fù)合納米粒子,殼聚糖-金納米粒子復(fù)合物(CS-nanoAu)依次組裝到玻碳電極表面形成具有高表面能和良好氧化還原活性的夾心結(jié)構(gòu)納米復(fù)合膜。
　　 6

14、.基于脂質(zhì)體信號增強(qiáng)的電化學(xué)免疫傳感器同時檢測血清中ProGRP和NSE
　　 采用分別包裹了抗壞血酸和尿酸的脂質(zhì)體作為信號放大的載體,利用免疫反應(yīng)的高特異性,結(jié)合電化學(xué)的高靈敏性,構(gòu)建了一種可同時檢測ProGRP和NSE的生物傳感技術(shù)。
　　 研究結(jié)果
　　 1.多腫瘤標(biāo)志物在惡性腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義
　　 2.多腫瘤標(biāo)志物判別函數(shù)的建立及診斷軟件的研制
　　 3.雙重標(biāo)記納米二氧化硅顆粒電

15、化學(xué)免疫傳感器檢測血清中IgG
　　 4.新型納米金包裹石墨烯納米復(fù)合物檢測癌胚抗原高靈敏電化學(xué)免疫傳感器的研究
　　 5.基于PB-SiO2納米復(fù)合物的信號增強(qiáng)的免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于檢測神經(jīng)化烯醇酶
　　 6.基于脂質(zhì)體信號增強(qiáng)的電化學(xué)免疫傳感器同時檢測血清中ProGRP和NSE
　　 結(jié)論
　　 1.多腫瘤標(biāo)志物在惡性腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義
　　 C-12蛋白芯片在腫瘤普查、診

16、斷、判斷預(yù)后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實(shí)用價值。但其具有診斷靈敏度低、特異度低,分析困難,無法準(zhǔn)確定位等缺點(diǎn),限制其臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。
　　 2.多腫瘤標(biāo)志物判別函數(shù)的建立及診斷軟件的研制
　　 Bayes法建立多腫瘤標(biāo)志物判別函數(shù)具有較高靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率,對腫瘤的診斷具有重要臨床價值。研制的軟件自動完成腫瘤診斷判別方程計(jì)算,為腫瘤臨床醫(yī)師提供了一種科學(xué)、便捷、高效的工具。
　　 3.雙

17、重標(biāo)記納米二氧化硅顆粒電化學(xué)免疫傳感器檢測血清中IgG
　　 成功研制一種靈敏度高、制備簡單的電化學(xué)免疫傳感器,通過使用HRP摻雜的二氧化硅作為標(biāo)記,使用夾心免疫分析模式,實(shí)現(xiàn)對人體血清中IgG的檢測。該方法的優(yōu)點(diǎn)就在于使用了雙重標(biāo)記納米顆粒作為檢測抗體,改善了夾心免疫分析方法,提高了該免疫分析的靈敏度。
　　 4.新型納米金包裹石墨烯納米復(fù)合物檢測癌胚抗原高靈敏電化學(xué)免疫傳感器的研究。
　　 成功研制了一種新型

18、的高靈敏的導(dǎo)電的納米標(biāo)記物用于構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器,該免疫傳感器可用于對痕量血清中CEA的檢測,為臨床腫瘤的診斷提供了一個新的方法。
　　 5.基于PB-SiO2納米復(fù)合物的信號增強(qiáng)的免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于檢測神經(jīng)化烯醇酶(NSE)
　　 成功構(gòu)建了檢測NSE電化學(xué)傳感器免疫傳感器,具有靈敏度高、響應(yīng)時間快、線性范圍寬等特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了微量NSE的定量檢測,表明該傳感器在NSE的診斷方面具有一定的應(yīng)用前景。