非人靈長類動物急性肝功能衰竭模型的建立.pdf

1、肝臟作為人體中最重要的器官之一,承擔著合成、分泌、代謝、解毒等多種復雜的功能,各種因為一旦造成肝細胞的大量壞死,將出現(xiàn)肝衰竭,導致機體代謝紊亂和毒性物質的堆積,而這反過來又加重了肝細胞的損傷,影響肝細胞的再生,形成肝衰竭的惡性循環(huán)。急性肝功能衰竭(acute liver failure ALF)是指由于各種致病因素作用于機體而導致肝細胞在短時間內(nèi)大量壞死或肝功能嚴重損害而引起的臨床綜合征群。臨床上以黃疸迅速增加、進行性神志改變,進而發(fā)展

2、至肝昏迷狀態(tài),并有出凝血機制異常、肝功酶學改變、腎功能衰竭甚至出現(xiàn)多臟器功能衰竭等為主要特點。病情進展快、病程兇險、預后差死亡率高,存活者往往直接進入肝硬化階段。該病一般包括暴發(fā)性肝功能衰竭及亞急性肝功能衰竭。暴發(fā)性肝功能衰竭是指急性肝功能損傷,從開始發(fā)病在8周之內(nèi)發(fā)展為出凝血功能異常和肝性腦??；亞急性肝功能衰竭指病人肝功能損傷從開始發(fā)病在26周內(nèi)進展成為肝性腦病。當前報道的唯一具有較好效果的治療是肝移植,存活率在50％～70％,但是由

3、于供體的短缺和倫理學等因為,限制了肝移植的開展。基于此種前提下,國內(nèi)外學者設計、構建了不同類型的人工肝系統(tǒng),希冀借助一種體外的機械、理化或者生物的裝置,清除患者體內(nèi)蓄積的各種有害物質,補充必需物質,改善內(nèi)環(huán)境,暫時替代衰竭肝臟的部分功能,為肝衰竭患者肝細胞再生及肝功能恢復創(chuàng)造條件,或等待供肝進行肝移植,從而降低患者病亡率。生物人工肝治療的原理是基于肝損傷的可逆性及肝細胞的可再生性,希望通過體外輔助裝置來暫時替代衰竭的肝臟功能,從而為肝移

4、植或者肝再生贏得時間,創(chuàng)造條件[4]。
　　 在臨床研究中,往往因為病情復雜、影響因素多、缺乏對照而難以確切判斷療效。因此,建立理想的ALF動物模型,是進行ALF研究的基礎。理想ALF動物模型的要求1974年Terblanche等提出理想ALF動物模型的5個要求,后來發(fā)展為6條,即是:可逆性、可復制性、動物死于肝衰、有治療時間窗、大動物模型、對實驗人員危害小。其中前4條要求最為重要,而后兩條則有利于模型的廣泛推廣。
　　

5、 在過去30年中,已發(fā)展了多種動物模型,多為急性肝衰竭(FHF)模型,方法主要包括外科手術、藥物和基因敲除。目前急性肝衰竭的動物模型多數(shù)為鼠、豬及犬的模型,與臨床患者臨床表現(xiàn)、生理生化指標和病理改變差異較大。與嚙齒類、犬類動物相比,非人靈長類動物(non-human primate,NHP)的生理特征以及免疫系統(tǒng)與人類相似,98％的基因與人類相同。構建非人靈長類動物猴ALF模型并研究其機理將為生物人工肝的臨床應用提供較好的基礎。

6、　　 研究背景:
　　 急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是臨床危重疾患之一,目前的內(nèi)科綜合治療效果不理想,病死率高達80％左右。當前報道的唯一具有較好效果的治療是肝移植,存活率在50％～70％[3,4],但是由于供體的短缺和倫理學等因為,限制了肝移植的開展。因此,建立理想的ALF動物模型,是進行ALF研究的基礎。1974年Terblanche[5]等提出理想ALF動物模型的5個要求,后來發(fā)展為6

7、條,即是:可逆性、可復制性、動物死于肝衰、有治療時間窗、大動物模型、對實驗人員危害小。其中前4條要求最為重要,而后兩條則有利于模型的廣泛推廣。(1)可逆性:采用一定的方法使實驗動物發(fā)生ALF,未經(jīng)治療的動物應該有較高的死亡率(80％左右)；而治療有效者,肝臟病損能夠可逆地恢復,動物得以存活。當前使用的一些建立模型方法,如完全阻斷血供造成肝壞死和全肝切除,均造成肝臟產(chǎn)生不可逆性的生物化學和組織學改變,故不能建立理想的ALF動物模型。(2)

8、可復制性:理想的ALF動物模型應該是重復性、穩(wěn)定性好。目前的建立模型方法一般較難預測動物的病情程度、存活時間、昏迷時間等基本參數(shù)。另外未經(jīng)治療的ALF動物應該幾乎全部死亡,但在實驗工作中這一基本要求很難做到。(3)動物死于肝衰:死亡率是鑒別和觀察療效的終點指標之一。實驗動物最終應該因ALF死亡而不是死于其它因為,這一點對于準確采集實驗數(shù)據(jù),正確判定療效非常重要。(4)有治療時間窗:從對動物施加損害性處理到動物死亡的時間間隔不應該太短,以

9、便有足夠的時間對其進行干預并評估治療效果。(5)大動物模型:大動物的ALF模型便于連續(xù)地采集血樣或組織進行系列性研究,所研究的各種治療方法也希望在與人近似的動物上進行實驗以便以后直接應用于臨床,如當前對生物人工肝支持系統(tǒng)的研究以使用大動物模型為宜。(6)對實驗人員危害小:所應用的任何化學品應該盡量對實驗人員無害。但目前使用的某些肝毒性物質,如四氯化碳、亞硝基胺等,由于對人體有一定毒性未能達到此項要求。目前的急性肝功能衰竭動物模型多是鼠、

10、豬、犬類。與嚙齒類、犬類動物相比,非人靈長類動物(non-human primate,NHP)的生理特征以及免疫系統(tǒng)與人類相似,98％的基因與人類相同,目前通過檢索國內(nèi)外文獻還未見非人靈長類動物急性肝功能衰竭模型的報道。因此探索和建立與人類相似猴ALF模型就十分必要。
　　 目的:
　　 構建一種穩(wěn)定的具有潛在可逆性和良好重復性的非人靈長類大動物急性肝衰竭模型,為了解人ALF的機制和救治建立基礎。本研究擬在氯胺酮(0.1

11、ml/kg)麻醉條件下,通過靜脈注射不同劑量的D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-gal)以建立食蟹猴ALF模型,觀察動物的臨床、生化及組織學變化特征,摸索猴ALF合適的D-gal劑量,為下一步探索急性肝功能衰竭的機制及救治奠定基礎。
　　 材料和方法:
　　 選取雄性食蟹猴作為模型動物。預實驗后將20只食蟹猴隨機分為4組:第一組為大劑量組(n=5),給藥劑量為0.45g/kg；第二組為中等劑量組(n=5

12、),給藥劑量為0.3g/kg；第三組為低劑量組(n=5),給予D-氨基半乳糖0.15g/kg第四組為對照組(n=5),不給予D-氨基半乳糖。氯胺酮(0.1ml/kg)肌內(nèi)注射麻醉下,在10min內(nèi)把D-氨基半乳糖溶液經(jīng)頸外靜脈一次性輸入實驗猴體內(nèi)。顱頂鉆一小洞,插入Codman微傳感器測量顱內(nèi)壓(ICP)的變化。術后動態(tài)觀察生存情況,術前及術后每天定時抽血送南方醫(yī)院檢驗科,用于測定肝功能、腎功能、血糖、血氨、凝血項、支鏈氨基酸和芳香族氨

13、基酸比等。觀察動物臨床表現(xiàn)及病程進展情況,記錄動物存活時間。死亡動物立即尸檢,動物死后作詳細尸檢并取肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、心臟、肺、胃腸和腦組織。光鏡標本均用10％的甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,HE染色,電鏡標本經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定,樹脂包埋,醋酸鈾、檸檬酸鉛染色,光鏡及電鏡下觀察上述組織的病理學變化。
　　 結果:
　　 第1組的平均存活時間是(56.1±8.1)h,有4/5的病食蟹猴死亡前出現(xiàn)肝昏迷,不能站立。第

14、2組的平均存活時間為(109.8±11.2)h,其中3/5的病食蟹猴出現(xiàn)肝昏迷。第3組以劑量為0.15g/kg D-氨基半乳糖胺引導的5只食蟹猴中,除1只98h后死亡外其余全部存活,在第4d開始好轉,之后全部指標漸恢復正常。第2組兩只食蟹猴的存活時間分別為105和120h,食蟹猴的血壓在給藥后都保持平穩(wěn),顱內(nèi)壓則明顯上升1倍以上,血清的轉氨酶在給藥后12h開始升高,并隨病程進展越來越高,血中的膽紅素、膽酸、氨、乳酸也逐漸上升。而血小板則

15、越來越低,凝血酶原時間越來越長。所有實驗食蟹猴的血液電解質和酸堿度一直保持在正常的范圍內(nèi)。血氣分析的結果也在正常范圍,沒有明顯的變化。直線相關分析顯示注射D-gal的動物存活時間與D-gal劑量呈顯著負相關。Kaplan-Meier生存分析表明各組實驗猴生存時間比較,(x2=21.933,P=0.000)差異有顯著性。尸檢發(fā)現(xiàn)所有給予D-gal的動物肝臟體積縮小,邊緣變銳,表面色澤斑駁,散在針尖至米粒大小出血點,肝臟切面有暗紅色淤血,黃

16、色乳靡狀壞死物質溢出,膽囊形態(tài)、大小正常,腸管有輕度到中度脹氣,腸壁充血水腫,有散在出血點,腎臟、脾臟、肺臟肉眼未見異常。腦組織重度水腫,以血管周圍間隙與星狀細胞周圍明顯。
　　 光鏡檢查發(fā)現(xiàn)對照組動物肝小葉結構完整,無肝細胞壞死征象。而注射D-gal的動物均出現(xiàn)肝細胞片狀壞死,伴有明顯的出血,肝細胞彌漫性腫脹,肝竇受壓變窄。肝細胞胞漿疏松化、空泡變性,部分肝細胞內(nèi)可見脂肪空泡。部分肝細胞核碎裂、溶解。部分匯管區(qū)可見中性粒細胞和

17、淋巴細胞浸潤。0.45g/kg的動物肝細胞呈現(xiàn)大片壞死,肝小葉結構不清,出血嚴重。電鏡檢查未注射D-氨基半乳糖胺時,肝臟超微結構示食蟹猴肝細胞胞漿內(nèi)糖原顆粒豐富,內(nèi)質網(wǎng)豐富無擴張,線粒體豐富無腫脹,嵴清晰,線粒體膜清楚,細胞核染色質均勻,核膜核仁清晰。注射D-氨基半乳糖胺時,細胞漿內(nèi)糖原顆粒均質化,粗面內(nèi)質網(wǎng)脫顆粒,線粒體腫脹,嵴模糊,部分線粒體溶解,細胞間毛細膽管微絨毛減少明顯,細胞核染色質集聚,核變形,核內(nèi)假包涵體形成。