DMT1腺病毒表達載體的構(gòu)建和功能研究.pdf

1、二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白(divalent metal transport 1，DMT1)，曾被稱為具天然抗性的巨噬細胞蛋白2(nature resistance-associated macrophage protein 2，Nramp2)，是哺乳類的跨膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白。DMT1的功能一是介導小腸的鐵吸收；二是介導內(nèi)吞小體的鐵移位。其mRNA存在兩種形式，即“+IRE”和“-IRE”型，“+IRE”的3'非翻譯區(qū)含有與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tansf

2、errin receptor，TfR)mRNA的3'非翻譯區(qū)相似的鐵調(diào)節(jié)元件(iran regulatory element，IRE)，“-IRE”型則不包含有IRE結(jié)構(gòu)。DMT1由12個跨膜區(qū)組成，第四跨膜區(qū)是其重要的功能區(qū)，如發(fā)生突變，將會嚴重干擾DMT1的攝鐵功能。研究發(fā)現(xiàn)DMT1在腦內(nèi)廣泛表達，其在腦內(nèi)某些部位表達異常可改變腦鐵代謝并與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神經(jīng)退行性疾病(neurodegen

3、erative disease，NDs)的鐵聚積有關(guān)。本研究構(gòu)建DMT1第四功能區(qū)的腺病毒表達載體并感染C6膠質(zhì)瘤細胞，研究其在DMT1攝鐵中的作用；用重組腺病毒vAd-DMTI+IRE和vAd-DMT1-IRE感染C6膠質(zhì)瘤細胞，RT-PCR和Western Blotting檢測目的基因在C6膠質(zhì)瘤細胞中的表達；感染重組腺病毒vAd-DMTI+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育后，用電感偶合等離子體．質(zhì)譜(indu

4、ctively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)測定細胞內(nèi)鐵含量；MTT比色法、DNA片斷化分析觀察鐵孵育對感染重組腺病毒vAd-DMTI+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞活性和凋亡的影響；測定感染重組腺病毒vAd-DMTI+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育后，細胞內(nèi)羥自由基(hydroxyl free radicals，OH·)和丙二醛(malond

5、ialdehyde，MDA)的含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)的活性；透射電鏡觀察感染重組腺病毒vAd-DMTI+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育后細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果表明： 1.用TRIzol一步法從人胚近段小腸中提取總RNA，RT-PCR擴增DMT1第四功能區(qū)基因片段，PCR產(chǎn)物

6、為380bp，測序結(jié)果正確。 2.目的基因經(jīng)雙酶切后克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，然后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183，經(jīng)細菌內(nèi)同源重組產(chǎn)生攜帶DMT1第四功能區(qū)基因的重組腺病毒載體pAd-DMT1-4。 3.重組腺病毒質(zhì)粒脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，包裝產(chǎn)生重組腺病毒vAd-DMT1-4。共聚焦顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白(green fluorescence protein

7、，GFP)，獲得具有穩(wěn)定感染性的重組腺病毒vAd-DMT1-4。 4.重組腺病毒vAd-DMT1-4感染C6膠質(zhì)瘤細胞，用共聚焦顯微鏡可觀察到綠色熒光蛋白表達隨時間增加而增加，36h達高峰，RT-PCR結(jié)果顯示感染重組腺病毒vAd-DMT1-4的C6膠質(zhì)瘤細胞目的基因表達較正常細胞顯著增加(P<0.05)。 5.重組腺病毒vAd-DMT1-4感染c6膠質(zhì)瘤細胞36h后，用含1mM FeSO<,4>的HBS(含Vc)液孵育

8、30min和60min，ICP-MS測定細胞內(nèi)鐵含量，分別與正常對照組和載體對照組比較細胞內(nèi)鐵含量無顯著性差異。 6.重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE感染C6膠質(zhì)瘤細胞，用共聚焦顯微鏡可觀察到GFP表達隨時間增加而增加，RT-PCR結(jié)果顯示感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞目的基因表達較正常細胞和載體對照顯著增加(P<0.05)。 7.Western

9、 Blotting結(jié)果顯示感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞目的基因表達較正常細胞和載體對照顯著增加(P<0.05)。 8.重組腺病毒vAd-DMTI+IRE和Ad-DMT1-IRE感染C6膠質(zhì)瘤細胞36h后，用含1mMFeSO<,4>的HBS(含VC)液孵育30min和60min，ICP-MS測定細胞內(nèi)鐵含量，發(fā)現(xiàn)DMTI+IRE和DMT1-IRE有攝鐵功能，感染重組腺病毒vAd-

10、DMTI+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)鐵含量明顯高于正常對照組和載體對照組(P<0.01)，且隨時間增加而增加。 9.高濃度鐵抑制C6膠質(zhì)瘤細胞活性，250μtM、300μM和350μM FeSO<,4>組與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，濃度越高抑制作用越明顯。感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育(200μMFeSO<

11、,4>)，細胞活性比正常對照組和載體對照組(P<0.05)顯著降低。 10.感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育(200μM FeSO<,4>)12h后進行DNAladder檢測，可觀察到典型的細胞凋亡條帶，而載體對照組和正常細胞組未見到“階梯狀”的DNA條帶。 11.感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育后細胞內(nèi)OH·和MDA

12、含量明顯升高，較對照組和載體對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。 12.感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育后細胞內(nèi)SOD和GSH-px活性明顯降低，較對照組和載體對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 13.電鏡下可見到感染重組腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6膠質(zhì)瘤細胞鐵孵育后線粒體腫脹，空泡化，無線粒體嵴，異染色質(zhì)增多，呈現(xiàn)細胞凋亡早期