佛波酯聯(lián)合TP化療方案的抗腫瘤作用.pdf

1、背景與目的：
　　化療是惡性腫瘤治療的重要手段之一，長(zhǎng)期臨床腫瘤化療所出現(xiàn)的耐藥性以及嚴(yán)重的不良反應(yīng)常常導(dǎo)致化療失敗，因此，尋找可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥或增加化療藥物敏感性的藥物、能夠減少化療藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)或提高機(jī)體正常組織耐受高劑量化療的藥物，對(duì)改善腫瘤治療效果具有重要意義。
　　佛波酯是大戟科植物中廣泛存在的四環(huán)二萜類化合物，其中活性比較強(qiáng)的成分是12-O-十四烷酰佛波醇-13乙酸酯(12-0-Tetradecanoyl

2、-Phorbol-13-Acetate，TPA)，它是蛋白激酶C的激動(dòng)劑。TPA具有多種生物學(xué)活性，作為潛在的抗白血病藥物研究已經(jīng)完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)。順鉑、紫杉醇是臨床常用的抗腫瘤藥物，療效肯定，但順鉑的腎臟毒性、紫杉醇的骨髓抑制等不良反應(yīng)成為劑量限制因素，同時(shí)也影響患者的生命質(zhì)量。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TPA可以增加肺癌，卵巢癌，宮頸癌，白血病等腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增加前列腺癌以及骨肉瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。臨床上腫瘤化療方案多數(shù)是聯(lián)合用藥，

3、其中順鉑和紫杉醇的聯(lián)合是肺癌、卵巢癌等多種腫瘤的化療方案，因此本研究擬考查TPA對(duì)以順鉑和紫杉醇聯(lián)用的TP方案是否具有增敏作用以及對(duì)TP方案毒性作用的影響，為探討腫瘤聯(lián)合化學(xué)治療的新方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1 TPA對(duì)TP方案的體外增敏作用
　　1.1細(xì)胞培養(yǎng)
　　人傳代肺癌A549、SPC-A-1細(xì)胞均在如下環(huán)境條件中培養(yǎng):溫度37℃±0.3℃，相對(duì)濕度≥95％，CO2濃度5％±0.1％。所用培養(yǎng)基

4、為含10％胎牛血清的1640。每3天傳代1次或視情況傳代。
　　1.2 TPA聯(lián)合順鉑和紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響
　　采用MTT比色法檢測(cè)藥物單用及聯(lián)合應(yīng)用情況下腫瘤細(xì)胞抑制率的變化，繪制量效曲線。并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)三藥聯(lián)用對(duì)抗腫瘤作用的影響。
　　2 TPA對(duì)TP方案小鼠體內(nèi)作用的影響
　　2.1 TPA對(duì)TP方案所致動(dòng)物死亡率的影響
　　急性毒性實(shí)驗(yàn)中，采用大劑量的順鉑和紫杉醇靜脈注射給藥，觀察T

5、PA對(duì)兩藥聯(lián)用所引起的小鼠的死亡率和存活時(shí)間的影響，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.2 TPA分別對(duì)順鉑和紫杉醇的劑量限制性毒性的影響
　　觀察TPA對(duì)順鉑的劑量限制性毒性腎毒性以及紫杉醇的骨髓抑制是否具有對(duì)抗作用，比較血肌酐、尿素氮、腎組織的病理變化以及外周血細(xì)胞，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.3荷瘤動(dòng)物體內(nèi)TPA對(duì)TP方案的抑瘤率和毒副作用的影響
　　運(yùn)用昆明鼠皮下接種小鼠肝癌細(xì)胞H22，接種成功后給予順鉑和紫杉醇

6、以及TPA，觀察TPA能否提高TP方案的抑瘤率以及降低其毒性反應(yīng)。
　　2.4TPA對(duì)TP方案所引起的腎臟氧化應(yīng)激的影響
　　采用昆明鼠，觀察TPA對(duì)腎組織MDA，GSH，SOD的影響，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，評(píng)價(jià)TPA的作用。
　　結(jié)果：
　　1 TPA對(duì)TP方案的體外增敏作用
　　1.1 TPA對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　TPA在小于5ng/ml的濃度下對(duì)A549和SPC-A-1細(xì)胞的增殖均無抑制作用，而在1

7、0ng/ml以上對(duì)該兩種細(xì)胞的增殖有明顯的抑制現(xiàn)象，并呈濃度依賴性。
　　1.2 TPA分別對(duì)順鉑和紫杉醇的增敏作用
　　1ng/ml和5ng/ml的TPA與順鉑共同作用72h之后對(duì)順鉑的增敏作用并沒有差異，因此實(shí)驗(yàn)選用1ng/ml TPA與順鉑聯(lián)合作用72h，A549細(xì)胞中順鉑的IC50下降了65.87％（P＜0.05，與順鉑單用組相比），增敏倍數(shù)2.92倍。SPC-A-1細(xì)胞中，順鉑的IC50下降了59.84％（P＜0.

8、05，與順鉑單用組相比），增敏倍數(shù)為2.49倍。但是TPA對(duì)紫杉醇沒有增敏作用。
　　1.3 TPA對(duì)TP方案的增敏作用
　　1ng/ml的TPA與不同濃度的順鉑和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用，共同作用72h之后，A549細(xì)胞中，順鉑的IC50下降了64.58％（P＜0.05，與順鉑聯(lián)合紫杉醇組相比），增敏倍數(shù)為2.82倍，在SPC-A-1細(xì)胞中，順鉑的IC50下降了51.29％(P＜0.05，與順鉑聯(lián)合紫杉醇組相比)，增敏倍數(shù)為2.05

9、倍。
　　2 TPA對(duì)TP方案小鼠體內(nèi)作用的影響
　　2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)
　　急性毒性實(shí)驗(yàn)中，一次性注射順鉑和紫杉醇之后，TP組動(dòng)物死亡率為86.67％，而TPA聯(lián)合TP組動(dòng)物的死亡率為26.67％，TPA單用組動(dòng)物沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，并且TPA聯(lián)合TP組的存活時(shí)間要明顯高于TP組，結(jié)果提示TPA可以明顯的降低TP方案引起的動(dòng)物的死亡，延長(zhǎng)其存活時(shí)間。
　　2.2 TPA分別對(duì)順鉑和紫杉醇的劑量限制性毒性的影響

10、r>　　在順鉑的腎毒性中，TPA可以明顯的降低血清肌酐和尿素氮的含量(P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，HE染色結(jié)果顯示，TPA聯(lián)合TP組與TP組相比，腎組織的損傷明顯減輕，腎小球充血輕微，并且腎小管擴(kuò)張較TP組相比明顯降低。TPA單用組對(duì)動(dòng)物的腎組織并沒有損傷現(xiàn)象，與對(duì)照組相比沒有明顯的差異。而TPA對(duì)紫杉醇的劑量限制性毒性，即骨髓抑制沒有保護(hù)作用，外周血細(xì)胞各組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.3荷瘤動(dòng)物體內(nèi)TPA

11、對(duì)TP方案抑瘤率和毒性作用的影響
　　各組小鼠的瘤重顯示，TPA單用組瘤重與對(duì)照組動(dòng)物瘤重相比并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); TP組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)，并且TPA聯(lián)合TP組與TP組相比P＜0.05，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而各組動(dòng)物的BUN和CRE， TPA聯(lián)合TP與TP組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P＜0.01)。腎組織的病理變化上來看，TPA聯(lián)合TP組與TP組相比，腎損傷輕微，腎小球充血不明顯，空泡形成較

12、少，球固縮也有明顯減輕。
　　2.4 TPA對(duì)TP方案所引起的腎臟氧化應(yīng)激的影響
　　通過測(cè)定腎組織中MDA，GSH和SOD的含量，結(jié)果顯示，TP模型組與TPA聯(lián)合模型組相比，MDA、GSH和SOD含量?jī)山M之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，而TPA組與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.TPA體外可以增加肺癌細(xì)胞對(duì)TP方案的敏感性。
　　2.TPA體內(nèi)可以增加TP方案的抗腫瘤