周期張應(yīng)力下TDSCs與(PLLA-CL)-Col支架構(gòu)建組織工程肌腱的研究.pdf

1、背景:
　　各種創(chuàng)傷及疾病導(dǎo)致的肌腱損傷在臨床上非常常見(jiàn)。有統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,全球每年至少有3000萬(wàn)的肌腱損傷病人。肌腱損傷后傳統(tǒng)的治療手段包括自體移植、同種異體移植、異種移植和假體材料移植等。但是這些肌腱再生重建技術(shù)均有各自的弊端,例如供體部位并發(fā)癥、疾病傳播、免疫排斥和修復(fù)不充分等。因此,臨床上急需尋找一種性能良好且來(lái)源充足的活性修復(fù)材料用于肌腱損傷的修復(fù)。
　　近20年來(lái),隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、移植技術(shù)和生物材料科學(xué)的發(fā)展,

2、臨床醫(yī)學(xué)正步入一個(gè)“再生醫(yī)學(xué)”的新階段,一種較理想的肌腱替代物——組織工程肌腱,通過(guò)重建與天然肌腱生物力學(xué)、生物化學(xué)和組織學(xué)相似的再生組織,有可能解決損傷肌腱的修復(fù)問(wèn)題。組織工程肌腱構(gòu)建的要素主要包括種子細(xì)胞、支架材料、力學(xué)刺激、生長(zhǎng)因子等。當(dāng)前,構(gòu)建功能性組織工程肌腱的瓶頸包括:獲得足夠的能向成熟肌腱細(xì)胞分化的種子細(xì)胞;制備良好生物相容性、力學(xué)性能的三維仿生支架材料;掌握促進(jìn)種子細(xì)胞分化及組織形成的力學(xué)刺激等理化因素。但是,目前這些問(wèn)

3、題沒(méi)有得到很好的解決,影響了肌腱組織工程的發(fā)展,制約了組織工程肌腱在臨床肌腱損傷再生修復(fù)治療中的應(yīng)用。
　　本研究針對(duì)這些現(xiàn)狀,旨在系統(tǒng)的研究功能性組織工程肌腱構(gòu)建所面臨的瓶頸問(wèn)題,最終目的為在周期性張應(yīng)力刺激條件下,肌腱干細(xì)胞(TDSCs)復(fù)合(聚乳酸-聚己內(nèi)酯)/膠原(P(LLA-CL)-Col)納米紗仿生支架構(gòu)建組織工程肌腱并促進(jìn)損傷肌腱的再生。研究?jī)?nèi)容包括:在種子細(xì)胞選擇、分化和調(diào)控方面,擬從兔髕腱組織分離、培養(yǎng)TDSCs

4、,檢測(cè)TDSCs多向分化潛能,為周期性牽張應(yīng)力刺激調(diào)控TDSCs增殖并誘導(dǎo)其向肌腱細(xì)胞分化,以TDSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程肌腱打下基礎(chǔ)。在組織工程支架方面,擬采用新的靜電紡絲技術(shù),研發(fā)一個(gè)既有較大三維(3D)空間結(jié)構(gòu)能利于種子細(xì)胞生長(zhǎng),又有一定力學(xué)承載特性能抗?fàn)坷墓δ苄约‰熘Ъ堋狿(LLA-CL)-Col復(fù)合支架,使之更符合天然肌腱組織生物學(xué)特性和力學(xué)特性。最終將利用研發(fā)的P(LLA-CL)-Col支架復(fù)合TDSCs,在牽張應(yīng)力

5、刺激下構(gòu)建組織工程肌腱,通過(guò)兔髕腱缺損損傷模型來(lái)評(píng)估所構(gòu)建的組織工程肌腱促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)的作用。
　　本研究分為三個(gè)部分:(1)兔 TDSCs的分離、培養(yǎng)及多向分化潛能鑒定;(2)制備一種新型,3D,大孔,取向排列的P(LLA-CL)-Col納米紗網(wǎng)絡(luò),檢測(cè)它的理化性能及生物相容性,評(píng)估它作為組織工程肌腱支架的可行性及優(yōu)勢(shì)。(3)在體外生物反應(yīng)器中,在牽張應(yīng)力刺激條件下培養(yǎng)TDSCs復(fù)合P(LLA-CL)-Col支架構(gòu)建的組織工程

6、肌腱,從各方面評(píng)價(jià)構(gòu)建組織工程肌腱的效果;在裸鼠體內(nèi),將TDSCs-P(LLA-CL)-Col復(fù)合物埋植在裸鼠背部皮下,評(píng)價(jià)模擬天然牽張應(yīng)力刺激對(duì)所構(gòu)建組織工程肌腱形成新生肌腱組織的效果;在兔髕腱損傷動(dòng)物模型中評(píng)估工程化的組織工程肌腱對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。本課題研究,將為組織工程肌腱應(yīng)用于臨床奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),最終為損傷肌腱的治療帶來(lái)新的方向。
　　第一章 TDSCs的分離和鑒定
　　目的:
　　在組織的修復(fù)過(guò)程中,種

7、子細(xì)胞扮演重要角色。肌腱細(xì)胞是損傷肌腱修復(fù)的主要功能細(xì)胞,它合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),維持肌腱組織的新陳代謝。但是,它們是終未細(xì)胞而無(wú)自我更新能力。TDSCs是近幾年發(fā)現(xiàn)的,來(lái)源于肌腱組織的干細(xì)胞,它是肌腱細(xì)胞的前體細(xì)胞,自身分化能力強(qiáng),可以作為肌腱再生的理想種子細(xì)胞。本研究的目的是分離、培養(yǎng)和鑒定TDSCs,評(píng)估其克隆形成與三系分化的能力。
　　方法:
　　采用 I型膠原酶和中性蛋白酶消化的方法分離獲取肌腱細(xì)胞

8、,通過(guò)低密度接種(2個(gè)細(xì)胞/cm2)單克隆培養(yǎng)的方法獲得TDSCs,通過(guò)結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)測(cè)定TDSCs的克隆形成能力,通過(guò)添加化學(xué)誘導(dǎo)因子分別誘導(dǎo) TDSCs成骨、成脂、成軟骨分化,通過(guò)0.1％茜素紅,0.5%的油紅O,和甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)TDSCs三系分化的能力。
　　結(jié)果:
　　兔髕腱組織經(jīng)I型膠原酶和中性蛋白酶消化分離后能獲得肌腱細(xì)胞,經(jīng)過(guò)單克隆培養(yǎng)后能獲得 TDSCs,第一代 TDSCs小部分呈鵝卵石樣的橢圓形,大部分呈

9、多角形和梭形。經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的TDSCs茜素紅染色可見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)形成,經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后的 TDSCs油紅 O染色顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含大量的脂滴,經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的TDSCs甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞內(nèi)含有大量藍(lán)色異染顆粒,證明了 TDSCs具備向不同方向分化的能力。
　　結(jié)論:
　　來(lái)源于肌腱組織的TDSCs具有干細(xì)胞的一般特性,可能是組織工程肌腱體外構(gòu)建和體內(nèi)損傷肌腱修復(fù)的理想的種子細(xì)胞來(lái)源。
　　第二章新型靜電紡 P(L

10、LA-CL)-Col納米紗組織工程肌腱支架的制備及其性能研究
　　目的:
　　以新型支架材料為基礎(chǔ)的組織工程為肌腱疾病的治療提供了潛在的治療策略。目前常用的組織工程肌腱支架的3D結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與天然肌腱基質(zhì)的不一樣。靜電紡絲制備支架的方法簡(jiǎn)單實(shí)用,制備的支架具有高孔隙率,纖維直徑為納米到微米級(jí),且結(jié)構(gòu)與 ECM結(jié)構(gòu)相似等特點(diǎn),目前傳統(tǒng)的靜電紡絲納米纖維支架的孔徑不利于種子細(xì)胞在其內(nèi)部生長(zhǎng),而由松散分散的納米纖維組成的靜電紡絲納

11、米紗支架,具有3D多孔的微觀結(jié)構(gòu),較大的孔徑和較高的孔隙率。本實(shí)驗(yàn)用具有良好彈性、生物降解性、有一定力學(xué)強(qiáng)度的聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(P(LLA-CL))和能改善細(xì)胞粘附性的 I型膠原作為原料,運(yùn)用新型靜電紡絲的方法制備3D,大孔隙,取向的,且形態(tài)和結(jié)構(gòu)類似于天然肌腱 ECM的納米紗網(wǎng)絡(luò)作為組織工程肌腱支架,并檢測(cè)它的理化性能和生物相容性。
　　方法:
　　在靜電紡絲過(guò)程中利用一種新型動(dòng)態(tài)水流收集系統(tǒng)制備P(LLA-CL)-

12、Col納米紗,使用傳統(tǒng)方法制備無(wú)規(guī)和取向納米纖維支架,評(píng)估支架的形態(tài),孔隙率,成分,和力學(xué)性能;以及在支架上培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的粘附,增殖,滲透,和肌腱特定 ECM基因表達(dá)的情況。
　　結(jié)果:
　　P(LLA-CL)-Col納米紗支架擁有3D取向的微觀結(jié)構(gòu),比無(wú)規(guī)和取向P(LLA-CL)-Col納米纖維支架有更大的孔徑和孔隙率。肌腱細(xì)胞生長(zhǎng)在納米紗支架上比在無(wú)規(guī)和取向納米纖維支架上呈現(xiàn)了更好的自然形態(tài),更好的細(xì)胞增殖和更多的EC

13、M分泌。重要的是,P(LLA-CL)-Col納米紗支架的空間結(jié)構(gòu)非常利于細(xì)胞遷移到支架內(nèi)部,以及肌腱相關(guān) ECM基因的表達(dá),并形成質(zhì)量更好的肌腱樣組織。此外,該納米紗支架能夠在肌腱組織的再生修復(fù)過(guò)程中提供一定的力學(xué)支持。
　　結(jié)論:
　　靜電紡絲P(LLA-CL)-Col納米紗是一種新型的,3D,大孔,取向排列的網(wǎng)絡(luò)支架,特別適合種子細(xì)胞在其表面及內(nèi)部生長(zhǎng),在組織工程肌腱的構(gòu)建中有很好的應(yīng)用前景。
　　第三章周期張應(yīng)力

14、對(duì)TDSCs-P(LLA-CL)-Col復(fù)合物生物學(xué)特性影響的研究
　　目的:
　　TDSCs是肌腱損傷修復(fù)及組織工程肌腱構(gòu)建的一個(gè)有吸引力的種子細(xì)胞來(lái)源。然而,這些細(xì)胞在肌腱組織工程中的應(yīng)用尚未被充分的探索。張應(yīng)力刺激在肌腱和韌帶的發(fā)育和損傷后的重建中發(fā)揮重要作用。本研究評(píng)估張應(yīng)力刺激下 TDSCs復(fù)合P(LLA-CL)-Col納米紗支架所構(gòu)建的組織工程肌腱的效果。
　　方法:
　　在體外生物反應(yīng)器中(本課題組

15、研制),對(duì)組織工程肌腱予以0.5 HZ,4%幅度,2 h/天的張應(yīng)力刺激培養(yǎng)14天(應(yīng)力刺激實(shí)驗(yàn)組),對(duì)照組靜置培養(yǎng),觀察應(yīng)力刺激對(duì)TDSCs的活性,增殖,腱系分化基因和蛋白表達(dá)的影響。在裸鼠體內(nèi),將4-5 cm長(zhǎng)的組織工程肌腱中的2 cm兩端縫合在裸鼠背部的脊上韌帶上(應(yīng)力刺激實(shí)驗(yàn)組),剩余大約2 cm一端與實(shí)驗(yàn)組部分相連,一端游離(未受力對(duì)照組),術(shù)后2,4,8周行活體成像,組織學(xué)及免疫組化檢測(cè)。最后將體外培養(yǎng)(應(yīng)力刺激實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照

16、組)后的組織工程肌腱移植到兔髕腱缺損部位,術(shù)后4,12周行組織學(xué)檢測(cè)和力學(xué)測(cè)試。
　　結(jié)果:
　　體外應(yīng)力刺激不影響TDSCs的細(xì)胞活性,能促進(jìn)TDSCs的增殖,以及促進(jìn)TDSCs向肌腱系分化;體內(nèi)天然的應(yīng)力刺激在TDSCs-P(LLA-CL)-Col復(fù)合物移植到裸鼠體內(nèi)后,同樣促進(jìn)了新生肌腱組織的形成。更重要的是,應(yīng)力刺激后的TDSCs-P(LLA-CL)-Col復(fù)合物能更好的促進(jìn)兔髕腱缺損的修復(fù),再生肌腱組織的膠原含量以