STAT4、STAT6與CBP相互作用及其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的檢測(cè).pdf

1、第一部分、STAT4、sTAT6與0BP相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與評(píng)價(jià)
　　 目的：構(gòu)建STAT4、STAT6的酵母表達(dá)質(zhì)粒和CBP的誘餌表達(dá)質(zhì)粒，并檢測(cè)誘餌蛋白的毒性、滲漏和自激活作用，為酵母雙雜交檢測(cè)STAT4、STAT6與CBP的相互作用做準(zhǔn)備。
　　 方法：PCR擴(kuò)增小鼠的STAT4、STAT6和CBP基因，分別克隆入酵母雙雜交系統(tǒng)的AD和BD載體，測(cè)序正確后，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋

2、白，western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)誘餌蛋白CBP的毒性、滲漏和自激活作用。
　　 結(jié)果：成功擴(kuò)增了小鼠的STAT4、STAT6和CBP基因，并分別正確克隆入AD和BD載體，測(cè)序結(jié)果符合要求，western blot證實(shí)上述蛋白均能在AH109中正確表達(dá)，誘餌蛋白CBP對(duì)酵母AH109細(xì)胞無(wú)毒性和滲漏作用，但檢測(cè)到自激活作用。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了用于檢測(cè)STAT4、STAT6與CBP相互作用的酵母雙

3、雜交系統(tǒng)，但檢測(cè)到誘餌蛋白CBP有自激活作用。
　　 第二部分、誘餌蛋白CBP自激活結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)
　　 目的：將CBP蛋白的各主要結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建到誘餌表達(dá)載體pGBKT7上，分別檢測(cè)其毒性、滲漏和自激活作用來(lái)明確CBP蛋白分子中起自激活作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　 方法：將CBP蛋白按主要結(jié)構(gòu)域分成CBP1-697，CBP967-1574和CBP1678-2175三個(gè)部分進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆入誘餌表達(dá)載體pGBKT7

4、，酶切和測(cè)序鑒定后將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CBP1-697、pGBKT7-CBP967-1574和pGBKT7-CBP1678-2175分別轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，western blot檢測(cè)誘餌蛋白表達(dá)情況，同時(shí)行毒性、滲漏和自激活作用檢測(cè)。將有自激活作用的CBP1-697所包含的TAZ1和KIX結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分為CBP1-436（包含TAZ1）和CBP529-1200（包含KIX）兩部分，同前進(jìn)行PCR.擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建、

5、轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)及毒性、滲漏和自激活作用檢測(cè)。
　　 結(jié)果：成功的將CBP蛋白分子的各主要結(jié)構(gòu)域分成幾個(gè)部分克隆入誘餌表達(dá)載體，使其在酵母AH109細(xì)胞中正確表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)CBP蛋白分子的TAZ1結(jié)構(gòu)域有自激活作用。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了可用于酵母雙雜交的CBP誘餌表達(dá)質(zhì)粒，明確了TAZ1結(jié)構(gòu)域是CBP起自激活作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　 第三部分、酵母雙雜交檢測(cè)STAT4、STAT6與CBP各主要結(jié)構(gòu)域間的相互作用<

6、br>　　 目的：酵母雙雜交檢測(cè)STAT4、STAT6與CBP各主要結(jié)構(gòu)域（TAZ1結(jié)構(gòu)域除外）間的相互作用。
　　 方法：將酵母表達(dá)質(zhì)粒pGADT7-STAT4/6分別與pGBKT7-CBP529-1200、pGBKT7-CBP967-1574和pGBKT7-CBP1678-2175共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，鋪相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)板，通過(guò)報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆。
　　 結(jié)果：pGADT7-STAT4分別與pGBK

7、T7-CBP529-1200、pGBKT7-CBe967-1574共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞時(shí)不能激活報(bào)告基因表達(dá)，與pGBKT7-CBP1678-2175共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞后可激活報(bào)告基因表達(dá)，pGADT7-STAT6與上述任何誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞均不能激活報(bào)告基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：酵母雙雜交檢測(cè)到STAT4與CBP1678-2175存在直接的相互作用，沒(méi)有檢測(cè)到STAT6與CBP各結(jié)構(gòu)域（TAZ1結(jié)構(gòu)域除外

8、）間的相互作用。
　　 第四部分、STAT4與CBP相互作用關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)
　　 目的：檢測(cè)STAT4蛋白分子與CBP相互作用中起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域。
　　 方法：PCR擴(kuò)增N-末端結(jié)構(gòu)域缺失的STAT4，并克隆入酵母表達(dá)載體pGADT7，酶切和測(cè)序鑒定后將pGADT7-STAT4-N123轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，western blot檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況，酵母雙雜交檢測(cè)STAT4-N123與CB

9、P1678-2175間的相互作用。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了不含有STAT4 N-末端結(jié)構(gòu)域的酵母表達(dá)質(zhì)粒pGADT7-STAT4-N123，但pGADT7-STAT4-N123與pGBKT7-CBP1678-2175共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞后不能激活報(bào)告基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：酵母雙雜交沒(méi)有檢測(cè)到STAT4-N123和CBP1678-2175存在相互作用。
　　 第五部分、免疫共沉淀對(duì)酵母雙雜交的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證

10、
　　 目的：免疫共沉淀驗(yàn)證STAT4與CBP1678-2175間的相互作用，同時(shí)分別檢測(cè)STAT4、STAT6與CBP1678-2175的相互作用。
　　 方法：PCR擴(kuò)增CBP1678-2175和CBP1-436并與C-Myc標(biāo)簽融合，然后轉(zhuǎn)克隆入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP，酶切、測(cè)序鑒定后western blot檢測(cè)融合蛋白在COS7細(xì)胞中的表達(dá)情況。將pGADT7-STAT4與pIRES2-EGFP-CB

11、P1678-2175共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，用HA標(biāo)簽抗體沉淀細(xì)胞裂解液，C-Myc標(biāo)簽抗體檢測(cè)CBP1678-217S-C-Myc融合蛋白，同法檢測(cè)STAT4、STAT6與CBP1-436的相互作用。
　　 結(jié)果：成功的將CBP1678-2175和CBP1-436與C-Myc標(biāo)簽融合后克隆入pIRES2-EGFP，且融合蛋白在COS7細(xì)胞中能正確表達(dá)。HA標(biāo)簽抗體可將CBP1678-2175與STAT4同時(shí)沉淀，但C