BAFF與TACI相互作用功能結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸的研究.pdf

1、B細(xì)胞激活因子(B cell activating factor, BAFF)是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員之一,它可特異性的刺激 B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體,對 B細(xì)胞的存活和發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。BAFF-R(BR3)、TACI、BCMA分別是BAFF的三個(gè)受體,它們分布在B細(xì)胞分化發(fā)育的不同時(shí)期,BAFF正是通過這些受體在 B細(xì)胞分化發(fā)育的各個(gè)階段及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用。研究表明: BAFF缺乏會導(dǎo)致外周 B細(xì)胞成熟缺陷

2、和降低免疫球蛋白的水平;而 BAFF過表達(dá)則會破壞免疫耐受,與許多自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE), sjogren氏綜合癥,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此,BAFF及其受體作為治療自身免疫疾病的特異性靶標(biāo),受到廣泛的關(guān)注。
　　受體 TACI與 BAFF具有高親和力,它可以特異性識別 BAFF并與之結(jié)合。因此,可溶性受體融合蛋白(TACI-Fc)可作為 BAFF抑制劑治療自身免疫疾病,目前該抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床

3、試驗(yàn)階段并取得初步成效。同時(shí),新型拮抗劑開發(fā)已成為目前的研究熱點(diǎn)。然而,BAFF是如何識別TACI發(fā)揮功能尚不十分清楚,確定 BAFF與 TACI相互作用的關(guān)鍵功能位點(diǎn)對于研制新型拮抗劑具有重要的指導(dǎo)意義。
　　本研究基于配體(BAFF)和受體(TACI)晶體結(jié)構(gòu)以及理論模擬獲得的三維構(gòu)象,借助計(jì)算機(jī)輔助分子對接技術(shù)、動力學(xué)模擬技術(shù)構(gòu)建配體-受體相互作用的復(fù)合物模型,通過計(jì)算機(jī)模擬的方式分析 TACI與 BAFF的結(jié)合模式以及 B

4、AFF被 TACI識別的關(guān)鍵區(qū)域。利用分子生物學(xué)突變實(shí)驗(yàn)以及功能評價(jià)方法對理論預(yù)測的抗原表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　具體工作如下:
　　一、通過分子生物學(xué)、免疫學(xué)等方法完成人 BAFF蛋白胞外段的表達(dá)純化及活性鑒定。
　　(1)將實(shí)驗(yàn)室保存的 pET32a(+)/BAFF、pET32a(+)/TACI質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)、通過融合蛋白上攜帶的 His標(biāo)簽進(jìn)行鎳離子親和純化,將獲得的蛋白(rhBAFF、rhTACI)通過SDS-

5、PAGE及Western Blot完成特異性鑒定;
　　(2)通過非還原電泳、Western Blot、HPLC對rhBAFF在PBS緩沖液中的存在形式做了分析;
　　(3)用ELISA方法檢測了rhBAFF與rhTACI的結(jié)合活性,并與商品化蛋白進(jìn)行了比較;
　　(4)通過小鼠B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在體外驗(yàn)證了rhBAFF的功能活性;
　　二、借助計(jì)算機(jī)模擬的方法、通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定 rhBAFF與 TACI相互作

6、用的重要區(qū)域。
　　(1)借助 BAFF以及受體 TACI晶體結(jié)構(gòu),選擇合適的力場參數(shù),在考慮溶劑效應(yīng)的情況下,利用計(jì)算機(jī)輔助分子對接技術(shù)經(jīng)動力學(xué)模擬構(gòu)建 BAFF與受體相互作用空間構(gòu)象;
　　(2)利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建 rhBAFF區(qū)域突變體的原核表達(dá)載體,在體外表達(dá)純化及鑒定并通過非還原電泳和HPLC的方法鑒定三聚體結(jié)構(gòu);
　　(3)通過ELISA及Octet蛋白相互作用動力學(xué)分析比較rhBAFF、rhBAFF區(qū)

7、域突變體與TACI的結(jié)合能力的差異;
　　(4)通過小鼠 B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及經(jīng)典 NF-κB的激活實(shí)驗(yàn)在體外評判rhBAFF與突變體功能活性的差異,確定TACI識別BAFF的功能域;
　　三、在確定 rhBAFF功能域的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對功能域中每個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行理論模擬,選擇關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行研究,經(jīng)實(shí)驗(yàn)評價(jià)確定了rhBAFF與TACI相互作用功能域的重要位點(diǎn)。
　　(1)利用獲得的 TACI與 BAFF作用復(fù)合物空間結(jié)構(gòu),通

8、過計(jì)算機(jī)輔助虛擬突變技術(shù)對203～211、233～238結(jié)構(gòu)域進(jìn)行逐點(diǎn)虛擬掃描突變,通過相互作用能量的變化進(jìn)而預(yù)測TACI識別BAFF的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　(2)利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建 rhBAFF單點(diǎn)突變體的原核表達(dá)載體,完成突變體的表達(dá)純化及鑒定;
　　(3)通過ELISA及Octet蛋白相互作用動力學(xué)分析比較rhBAFF、rhBAFF單點(diǎn)突變體與TACI的結(jié)合能力的差異;
　　(4)通過小鼠 B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及經(jīng)典

9、NF-κB的激活實(shí)驗(yàn)在體外評判rhBAFF與單點(diǎn)突變體的功能活性差異確定TACI識別BAFF的關(guān)鍵功能位點(diǎn);
　　具體結(jié)果如下:
　　一、獲得了高純度有活性的人 BAFF胞外段及受體 TACI胞外段的重組融合蛋白
　　(1)經(jīng)原核表達(dá)、親和純化,獲得 rhBAFF、rhTACI的可溶表達(dá)蛋白,經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot鑒定,所表達(dá)蛋白的純度高、特異性強(qiáng);
　　(2)經(jīng)非還原電泳、Western

10、Blot、HPLC分析 rhBAFF在 PBS緩沖液中的確為三聚體形式存在且純度超過90％;
　　(3)用ELISA雙夾心法證實(shí)rhBAFF能夠特異性的結(jié)合rhTACI,與商品化蛋白相比無明顯差異;
　　(4)通過小鼠B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在體外驗(yàn)證了rhBAFF的促增殖活性;
　　二、明確了BAFF與TACI相互作用的關(guān)鍵功能區(qū)域
　　(1)利用獲得的 BAFF與受體作用復(fù)合物空間構(gòu)象,通過分子間氫鍵形成理論、距離幾何

11、學(xué)以及計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)從理論上合理判別 BAFF受體 TACI識別 BAFF的功能位點(diǎn);在合理考慮 BAFF二級結(jié)構(gòu)以及分子內(nèi)氫鍵的條件下,通過計(jì)算機(jī)輔助分子模擬合理設(shè)計(jì)BAFF的五個(gè)區(qū)域突變體;
　　(2)構(gòu)建了 rhBAFF(突變體)/pET32a(+)的原核表達(dá)載體;成功表達(dá)rhBAFF的片段突變體:M1(158-165)、M2(203-211)、M3(225-231)、M4(233-238)、M5(264-269),并通過

12、鎳離子親和介質(zhì)純化得到高純度的目的蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定正確,Western印跡和HPLC的結(jié)果證實(shí)在非還原條件下突變體的分子量約為110bp,均為三聚體形式;
　　(3)ELISA與蛋白相互作用動力學(xué)分析結(jié)果表明突變體 M2、M4、M5的結(jié)合 TACI的能力顯著降低。小鼠 B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和經(jīng)典 NF-κB激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突變體 M2、M4與 rhBAFF相比的生物學(xué)活性明顯降低,初步確定rh

13、BAFF的突變體M2、M4突變的區(qū)域203-211,233-238為BAFF的功能區(qū)域;
　　三、明確了rhBAFF與TACI相互作用功能域的關(guān)鍵位點(diǎn)
　　(1)通過虛擬單點(diǎn)突變對 BAFF與 TACI相互識別的關(guān)鍵位置(M2、M4)進(jìn)行理論預(yù)測,經(jīng)相互作用能的變化動態(tài)分析了單點(diǎn)突變對 BAFF構(gòu)象以及BAFF與TACI作用的影響,得出M208、G209、H210、Q234、M236、P237是TACI識別BAFF的關(guān)鍵位點(diǎn)

14、。
　　(2)通過分子生物學(xué)定點(diǎn)誘變技術(shù)將理論模擬的重要位點(diǎn)構(gòu)建為原核表達(dá)載體;體外表達(dá)純化得到高純度的目的蛋白,同樣的方法證實(shí)單點(diǎn)突變體在溶液中仍以三聚體形式存在;
　　(3)經(jīng) ELISA、蛋白相互作用動力學(xué)分析評價(jià)突變體的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)M208、G209、H210、M236、P237突變后 rhBAFF與 TACI的相互作用能明顯降低。同時(shí),活性分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與結(jié)合實(shí)驗(yàn)相符,證實(shí) M208、G209、M236、P237