XAV939對裸鼠宮頸癌HeLa細胞移植瘤抑制作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　子宮頸癌(Cervical carcinoma，CC)是倍受世界關(guān)注的女性高發(fā)惡性腫瘤之一，嚴重威脅著全球廣大女性的身心健康。目前宮頸癌的治療以手術(shù)、化療和放療為主，但手術(shù)和放療有一定的適用范圍，往往對復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤難以收到好的效果，化療因其毒性作用大且易產(chǎn)生耐藥性而嚴重影響了患者的治療效果及生活質(zhì)量。所以，尋求一種高效低毒更有針對性的治療手段尤為重要。
　　目前已證實高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生

2、發(fā)展最重要的致病因素，但是其導致宮頸組織惡變的發(fā)病機制并未完全闡明。近年來，隨著人們對宮頸癌發(fā)病機制的深入探討，有學者指出 Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可能是繼HPV持續(xù)感染之后促進宮頸癌發(fā)生發(fā)展的“第二次重大事件”。同期人們還發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中端粒酶的表達高達90％，有學者猜測端粒酶高表達可能是促進高危型HPV感染的宮頸組織繼續(xù)惡變的關(guān)鍵步驟。
　　本課題組正是通過對國內(nèi)外相關(guān)研究的對比和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)了與宮頸癌的發(fā)

3、生發(fā)展關(guān)系密切的端粒酶和 Wnt/β-catenin信號通路存在著一個關(guān)鍵交互點—端錨聚合酶（TRF1-interacting ankyrin-related ADP-ribose polymerase，Tankyrase）。Huang等學者利用化學遺傳學法篩選得到的XAV939就是一個專門為Tankyrase制備的特殊化學小分子抑制劑。前期實驗工作中，我們通過MTT法、流式細胞儀、免疫印跡等體外細胞實驗技術(shù)方法已證明了 XAV939有

4、顯著抑制宮頸癌 HeLa細胞的增殖，降低Tankyrase和β-catenin蛋白的表達，阻滯細胞周期于G1期并誘導其調(diào)亡；聯(lián)合一定劑量的鉑類（奈達鉑）藥物時，則可提高宮頸癌HeLa細胞對奈達鉑的敏感性，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。
　　但前期研究畢竟是建立在腫瘤細胞水平，不能反映出宮頸癌的本來面目，因此，本部分實驗將進一步擬通過構(gòu)建人宮頸癌HeLa細胞裸鼠移植瘤動物模型，來觀察 XAV939的活體抑瘤效果，以期為該藥應(yīng)用于臨床的可行性提供科學

5、依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1、構(gòu)建人宮頸癌HeLa細胞裸鼠皮下移植瘤模型（HeLa細胞荷瘤裸鼠）：體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞，在無菌條件下將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞株接種到裸鼠背部皮下，每日觀察裸鼠的一般情況及移植瘤生長情況，待腫瘤體積達100mm3左右且瘤塊大小均勻時，符合本實驗對模型的要求。
　　2、動物分組及給藥：將40只荷瘤裸鼠隨機分為4組：模型對照組、XAV939組、順鉑（Cisplatin

6、，DDP）組、XAV939聯(lián)合DDP組，每組10只。4組裸鼠分別給予不同藥物干預(yù)，其中XAV939組每日每只給予0.2mg的XAV939，DDP組每日給予2mg/kg的DDP，聯(lián)合組每日分別給予上述劑量的XAV939和DDP，模型對照組給予0.1ml的10%DMSO，4組裸鼠均采用腹腔注射治療，連續(xù)干預(yù)10天。
　　3、觀察指標與取材：觀察經(jīng)不同藥物干預(yù)后裸鼠的一般狀況、移植瘤的生長情況及體重改變，定期測量移植瘤的體積大小，繪制動

7、態(tài)變化生長曲線并計算抑瘤率；給藥結(jié)束后處死裸鼠，完整剝離移植瘤并稱重，制作石蠟切片。
　　4、相關(guān)指標檢測：蘇木素—伊紅（Hematoxylin Eosin，HE）染色觀察移植瘤細胞病理形態(tài)學的變化；免疫組化法（IHC）分析移植瘤組織中的 Tankyrase及β-catenin蛋白的表達情況；原位缺口末端標記法（TUNEL法）檢測移植瘤組織細胞凋亡指數(shù)（Apoptosis index，AI）。
　　采用SPSS19.0統(tǒng)計軟

8、件包分析相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，以α=0.05作為檢驗水準。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建了人宮頸癌HeLa細胞皮下移植瘤裸鼠模型，成瘤率約89.13％（41/46）。
　　2、根據(jù)裸鼠移植瘤體積繪制的腫瘤動態(tài)變化生長曲線可見，用藥干預(yù)7日后，與對照組相比，XAV939和DDP藥物干預(yù)后均可對移植瘤的生長產(chǎn)生抑制作用（P＜0.05），兩藥聯(lián)合組抑制移植瘤生長的作用更明顯（P＜0.01）；XAV939和 DDP兩者效果相當，差異無

9、統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。處死荷瘤裸鼠后，裸鼠的瘤體重量與模型對照組相比均有所降低，其中 XAV939+DDP用藥組瘤重（0.94±0.62g）最低（P＜0.05）；XAV939組和 DDP組比較，差異無意義（P＞0.05）。抑瘤率聯(lián)合組為61.16%，高于XAV939組（39.67%）和DDP組（45.45%）。
　　3、HE染色法結(jié)果顯示，XAV939組、DDP組、XAV939聯(lián)合DDP組裸鼠的移植瘤組織均出現(xiàn)明顯凋亡及壞死

10、改變。
　　4、免疫組化陽性區(qū)域積分光密度值（IOD）結(jié)果顯示，模型對照組較陰性對照組移植瘤瘤細胞中 Tankyrase和β-catenin的表達明顯升高。XAV939聯(lián)合DDP組和XAV939單藥組的Tankyrase和β-catenin的蛋白表達水平均較模型對照組顯著性降低（P＜0.01），DDP組降低不明顯（P＞0.05）。聯(lián)合組與單藥XAV939組相比，前者兩種蛋白的降低幅度明顯（P＜0.05）。
　　5、TUNEL

11、法細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與模型對照組相比，XAV939和DDP在裸鼠體內(nèi)均能引起移植瘤細胞的凋亡（P＜0.05），且XAV939聯(lián)合DDP用藥組的凋亡作用最明顯。各組凋亡指數(shù)分別為模型對照組（5.29±0.43）%、XAV939組（12.46±1.17）%、DDP組（10.27±0.96）%、聯(lián)合組（25.13±2.24）%。
　　結(jié)論：
　　1、裸鼠皮下接種HeLa細胞可成功構(gòu)建宮頸癌裸鼠皮下移植瘤模型。
　　2、端