破骨細胞功能相關分子CTSK與ClC-7的臨床及基礎研究.pdf

1、骨改建是維持骨骼質量、強度以及鈣鹽平衡必不可少的過程，是破骨細胞介導的骨吸收過程和成骨細胞介導的骨形成過程協(xié)同作用的結果。一旦破骨細胞與成骨細胞之間的平衡被打破將會導致骨形態(tài)和結構的異常，從而引發(fā)一系列骨代謝性疾病。近年來隨著細胞生物學及分子遺傳學等學科的發(fā)展，破骨細胞在遺傳性骨病中的作用逐漸被揭開。有研究表明：電壓門控氯離子通道7（voltage-gatedchloridechannel7gene，CLCN7）及組織蛋白酶K（cath

2、epsinK，CTSK）等十余個基因異常均可引起破骨細胞功能障礙，進而導致遺傳性骨硬化性疾病。本研究選擇了3例CTSK或CLCN7基因突變所致的遺傳性骨病患者進行相關的臨床和基礎研究，旨在探討破骨細胞功能相關分子CTSK與ClC-7參與疾病發(fā)生的機理，為相關疾病的診斷、預防及治療提供理論依據(jù)。
　　CTSK基因突變所致致密性成骨不全的臨床和基礎研究
　　作為破骨細胞重要的功能分子，CTSK主要參與降解骨有機基質，并可以通過調(diào)

3、控破骨細胞凋亡控制破骨細胞數(shù)量。CTSK基因突變將導致一類罕見的常染色體隱性遺傳性疾病——致密性成骨不全。本研究對1996年以來文獻報道的109個家系中的159例致密性成骨不全患者進行了回顧性研究，結果發(fā)現(xiàn)：①其中59個家系（涉及104例患者）的基因分析發(fā)現(xiàn)了33種不同的CTSK基因突變類型，主要以錯義突變?yōu)橹鳎?9.70％），且位于6號外顯子的Arg241和位于7號外顯子的Ala277是突變的高發(fā)位點；59個家系中除了1個單親二倍體家

4、系外，攜帶純合子突變的家系共44個（74.58％），攜帶復合雜合子突變的家系為14個（23.73％）。②根據(jù)74個家系中97例致密性成骨不全患者的臨床表征，本研究發(fā)現(xiàn)身材矮小、骨密度增高、顱縫不閉合、顱骨膨隆、頻發(fā)骨折、下頜角變鈍、頜骨發(fā)育不良、四肢短小伴指/趾端溶骨是該病最常見的八大表征。③除了錯義突變患者指/趾端溶骨和下頜角變鈍陽性率較高外（P<0.05），其余基因型與表型之間沒有明確的關系。根據(jù)回顧性研究的結果，我們首次創(chuàng)建了CT

5、SK基因突變數(shù)據(jù)庫（http://www.centralmutations.org/Lsdb.php＃CTSK）。
　　為了進一步研究CTSK功能，探討CTSK參與疾病發(fā)生的機理，本部分研究選擇了我科接診的一例致密性成骨不全患者，在全面檢查、基因分析和家系研究的基礎上不但證實了該患者的診斷（該患者30年來一直被診斷為骨硬化癥），還發(fā)現(xiàn)了一對新的CTSK雜合突變位點（p.Trp29X和p.Tyr283Cys）、2個父系p.Tyr28

6、3Cys攜帶者和7個母系p.Trp29X攜帶者。同時提出顱頜面部特征在致密性成骨不全的鑒別診斷中具有重要意義。
　　對該患者接受死骨清除術時一并去除的左側上頜磨牙進行MicroCT掃描和組織學觀察，結果發(fā)現(xiàn)：牙根周圍牙骨質明顯增厚（平均厚度為1.30±0.42mm），牙骨質與周圍牙槽骨之間沒有明確的界限，根管狹窄伴部分鈣化閉鎖，但牙本質無明顯異常。從而提出CTSK除了在骨代謝方面發(fā)揮重要作用外，很可能參與牙骨質的形成并發(fā)揮重要作用

7、。同時提出了致密性成骨不全患者拔牙后繼發(fā)頜骨骨髓炎的一個可能機制：增厚的牙骨質與周圍牙槽骨之間沒有明確的界限，使得拔牙時容易損傷患牙周圍的牙槽骨，增大拔牙創(chuàng)面，造成更多的牙槽骨暴露，從而導致拔牙后繼發(fā)頜骨骨髓炎的風險增大。
　　免疫功能相關研究發(fā)現(xiàn)該患者外周血總IgE和抑制性T淋巴細胞升高、IL-17A水平和輔助性T淋巴細胞降低。利用白芍總甙膠囊和胸腺肽腸溶膠囊進行免疫調(diào)節(jié)治療12周后，各項異常的免疫指標均有不同程度的改善，且右側

8、上頜骨骨髓炎相關的臨床癥狀逐漸緩解，口內(nèi)病灶區(qū)新生肉芽組織形成并逐漸增大，部分覆蓋拔牙創(chuàng)底。該患者外周血IL-17A水平降低不僅預示著CTSK可能在人免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，同時也揭示了致密性成骨不全患者拔牙后繼發(fā)頜骨骨髓炎的又一可能機制：輔助性T淋巴細胞17及其相關細胞因子的匱乏導致致密性成骨不全患者抵抗外源微生物感染的能力減低，從而增加拔牙后頜骨骨髓炎發(fā)生的風險。
　　CLCN7基因突變所致骨硬化癥的臨床和基礎研究
　　

9、ClC-7作為一種Cl-/H+反向轉運體位于破骨細胞的褶皺緣上，通過控制氯離子通透性，調(diào)控骨吸收陷窩內(nèi)的pH值。CLCN7基因突變將導致一組遺傳性疾病——骨硬化癥，根據(jù)其遺傳方式、臨床特征、疾病的發(fā)病年齡以及嚴重程度，可以分為三型：常染色體隱性遺傳性骨硬化癥（autosomalrecessiveosteopetrosis，ARO）、常染色體顯性遺傳性骨硬化癥Ⅱ型（autosomaldominantosteopetrosistypeⅡ，A

10、DOⅡ）、中間型常染色體隱性遺傳性骨硬化癥（intermediateautosomalrecessiveosteopetrosis，IARO）。本部分研究選擇2例不同類型的CLCN7基因突變導致的骨硬化癥患者進行了相關的臨床和基礎研究。
　　通過詳細的臨床研究和CLCN7基因測序分析，證實了病例2為中國首例IARO患者，并發(fā)現(xiàn)了一個新的CLCN7純合突變位點p.Pro470Leu，其母為該位點的雜合攜帶者。同時發(fā)現(xiàn)該患者表現(xiàn)有睪丸

11、及陰莖發(fā)育障礙，染色體核型分析發(fā)現(xiàn)其Y染色體增大（Yq+）。在以往的研究中，并未見骨硬化癥患者表現(xiàn)有生殖系統(tǒng)發(fā)育障礙的報道。但CLCN7基因突變、Yq+和男性外生殖器發(fā)育障礙之間是否存在相關性還有待于進一步研究。
　　CLCN7基因測序分析，明確了病例3為CLCN7基因雜合突變（p.Arg286Trp）導致的ADOⅡ。外周血免疫球蛋白、IL-17水平及淋巴細胞亞型分析發(fā)現(xiàn)該患者外周血輔助性T淋巴細胞輕度降低，余未見明顯異常。ClC

12、-7在人免疫系統(tǒng)中的作用還有待于進一步研究。
　　本部分研究還發(fā)現(xiàn)病例2、3均表現(xiàn)有部分后牙埋藏伴不同程度的牙根發(fā)育障礙，于是首次提出ClC-7可能參與牙根發(fā)育，且其在牙根發(fā)育中的作用存在時空效應和劑量效應的假設。
　　結論
　　本研究通過對159例致密性成骨不全患者的文獻回顧性研究，得出了致密性成骨不全的臨床及分子遺傳學特征，并首次創(chuàng)建了CTSK基因突變數(shù)據(jù)庫。通過對3例CTSK或CLCN7基因突變所致的遺傳性骨病患