黃芩苷、IgY抗白色念珠菌作用機(jī)制研究.pdf

1、目的運(yùn)用生化定量分析、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)手段，檢測(cè)黃芩苷、IgY對(duì)白色念珠菌的MIC值，研究黃芩苷、IgY作用白色念珠菌后，其琥珀酸脫氫酶(SDH)、細(xì)胞色素氧化酶(coo)、Ca<'2+>-Mg<'2+>ATPase活性的改變及細(xì)胞周期的變化和凋亡情況，以探討黃芩苷抗白色念珠菌作用靶位，為探索中藥活性成分抗真菌作用機(jī)理提供依據(jù)。方法 1檢測(cè)黃芩苷對(duì)白色念珠菌的MIC及IgY對(duì)黃芩苷抗白色念珠菌MIC的影響：參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員

2、會(huì)NCCLS M-27A方案推薦的《酵母菌液基稀釋法抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)》。2檢測(cè)白色念珠菌經(jīng)黃芩苷及IgY作用后SDH酶活力、cco酶、ATPase活力的變化：實(shí)驗(yàn)采用三因素四水平正交設(shè)計(jì)(三因素為黃芩苷濃度、IgY濃度、作用時(shí)間；黃芩苷濃度有0mg/m1、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml四水平，IgY濃度為0mg/ml、0.5mg/ml、 Img/ml、2mg/ml四水平，作用時(shí)間為6h、12h、24h、48h四水

3、平)，加入黃芩苷、IgY作用白色念珠菌至相應(yīng)時(shí)間后，收集白色念珠菌，制備菌懸液，反復(fù)凍融研磨，差速離心法提取白色念珠菌線粒體作為檢測(cè)樣品；Lowry法檢測(cè)線粒體蛋白質(zhì)含量；根據(jù)酶的不同在樣品中加入相應(yīng)試劑，用分光光度計(jì)分別于600、550、640nm處檢測(cè)吸光度(0D)值下降速度，計(jì)算SDH酶、cco酶、Ca<'2+>-Mg<'2+>ATPase活力。3流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)白色念珠菌經(jīng)黃芩苷、IgY作用后細(xì)胞周期及凋亡情況：實(shí)驗(yàn)采用

4、完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計(jì)(兩因素分別為藥物和作用時(shí)間；藥物有0mg/m1、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml黃芩苷、Img/mllgY、0.5mg//m1黃芩苷聯(lián)合1mg/mlIgY六個(gè)水平，作用時(shí)間有12、24、48h三個(gè)水平)，收集經(jīng)藥物作用了相應(yīng)時(shí)間的白色念珠菌，制備菌懸液，反復(fù)凍融后，加入PI綜合染液，4℃染色數(shù)小時(shí)，去除PI，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果1黃芩苷對(duì)白色念珠菌的MIC為0.5mg/ml，加

5、入0.5、l、2mg/mlIgY后均使黃芩苷MIC降低為0.25mg/ml，2 0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml黃芩苷濃度組白色念珠菌SDH活力明顯低于0mg／ml黃芩苷濃度組(P<0.05)，且出現(xiàn)黃芩苷濃度越高SDH活力越低的趨勢(shì)，但0.25mg／ml、0.5mg／ml、1mg／ml黃芩苷濃度組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同IgY濃度組間、不同作用時(shí)間組間白色念珠菌SDH活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.

6、05)。3白色念珠菌經(jīng)不同濃度黃芩苷、不同濃度工gY作用不同時(shí)間后，其CCO酶活力均無(wú)明顯差異(P>0.05)，黃芩苷與IgY之間未見(jiàn)交互作用。4 0.25mg／ml、0.5mg／ml、1mg／ml黃芩苷濃度組與Omg／ml黃芩苷濃度組比較， Ca<'2+>-Mg<'2+>ATPase活力差異顯著，黃芩苷濃度越高，Ca<'2+>-Mg<'2+>ATPase活力越低，IgY和作用時(shí)間對(duì)Ca<'2+>-Mg<'2+>ATPase活力沒(méi)有明

7、顯影響(P>0.05)。 5隨著黃芩苷濃度的升高，白色念珠菌處于G<,0>／G<,1>期的細(xì)胞數(shù)比例增加，細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)下降(P<0.01)，單純1mg／m1IgY作用與不加藥物的對(duì)照組相比，G<,0>／G<,1>期的細(xì)胞數(shù)比例及細(xì)胞增殖指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.5mg／ml黃芩苷與1mg／mlIgY聯(lián)合使用可顯著增加白色念珠菌的凋亡率。結(jié)論 1 黃芩苷具有明顯的抗白色念珠菌作用，抗白色念珠菌IgY可增強(qiáng)黃芩苷的