人肝癌細(xì)胞Fas-FasL途徑免疫逃逸機(jī)制及其反義寡核苷酸、細(xì)胞因子的逆轉(zhuǎn)作用.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞凋亡及機(jī)體免疫功能的異常關(guān)系密切，通過Fas/FasL系統(tǒng)抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡以及反擊免疫細(xì)胞使 T 細(xì)胞凋亡，是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一。本課題通過對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15的Fas、FasL及其功能的檢測，探討肝癌細(xì)胞通過Fas/FasL途徑的免疫逃逸機(jī)制；并通過分析肝癌組織細(xì)胞Fas-670位點(diǎn)基因多態(tài)性，探究肝癌細(xì)胞Fas表達(dá)低下的原因；通過將FasL反義寡脫氧核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染入肝

2、癌細(xì)胞及將Fas ASODN轉(zhuǎn)染入T 細(xì)胞，研究Fas、FasL ASODN抑制肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞免疫逃逸的作用機(jī)制；通過干擾素．a(chǎn)上調(diào)肝癌細(xì)胞 Fas 表達(dá)，研究細(xì)胞因子對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。 方法：(1)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測肝癌細(xì)胞HepG2.2.15表面 Fas 及FasL的表達(dá)；(2)用激活性 Fas 單抗 CHll 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法研究肝癌細(xì)胞對(duì) Fas 介導(dǎo)凋亡的抵抗；(3)用Hep

3、G2.2.15細(xì)胞與 Jurkat 細(xì)胞共培養(yǎng)法研究肝癌細(xì)胞表面 FasL 誘導(dǎo) T 細(xì)胞凋亡的機(jī)制。(4)用PCR-RFLP法分析肝癌組織細(xì)胞Fas-670位點(diǎn)的基因多態(tài)性。(5)根據(jù) Fas 及 FasL 基因序列設(shè)計(jì)合成特異的互補(bǔ)于 mRNA 起始密碼區(qū)的 Fas 及 FasL ASODN，并設(shè)同長度的與 mRNA 起始密碼區(qū)序列相同的正義寡脫氧核苷酸(SODN)做對(duì)照，均經(jīng)硫代磷酸化修飾。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇120nmol/L、

4、200nmol/L、280nmol/L為轉(zhuǎn)染液的終濃度，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)導(dǎo)FasL ASODN) 入 HepG2.2.15細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞表面FasL表達(dá)的變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測細(xì)胞FasL mRNA的變化，用與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)法檢測肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的變化，用CH11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法檢測肝癌細(xì)胞凋亡的變化。用同樣的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas ASODN入Jurkat細(xì)胞，并檢測轉(zhuǎn)染后，Jurkat

5、細(xì)胞表面Fas表達(dá)、Fas mRNA的表達(dá)、以及與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后凋亡率的變化。(6)針對(duì)肝癌細(xì)胞低表達(dá)Fas并抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡，用干擾素-α(IFN-α)上調(diào)細(xì)胞Fas表達(dá)，用CH11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法檢測肝癌細(xì)胞凋亡的變化。 結(jié)果： 第一部分：人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15 Fas/FasL的功能與免疫逃逸機(jī)制 肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞表面Fas表達(dá)率為1.24％；用激活性Fas單抗CH11誘導(dǎo)細(xì)

6、胞凋亡的方法顯示，HepG2.2.15細(xì)胞加入CH11后的凋亡率與加入同型對(duì)照IgM的陰性對(duì)照組比較無明顯差異，而作為陽性對(duì)照組的Jurkat細(xì)胞加入CH11后，其凋亡率卻顯著增高；且實(shí)驗(yàn)組繼發(fā)性死細(xì)胞數(shù)明顯低于陽性對(duì)照組。HepG2.2.15細(xì)胞FasL的表達(dá)率為18.03％，與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，凋亡率為21.41％：用FasL中和抗體NOK-2封閉HepG2.2.15細(xì)胞表面的FasL后，Jurkat

7、細(xì)胞的凋亡率下降至8.91％。 第二部分：肝癌組織Fas啟動(dòng)區(qū)-670位點(diǎn)基因多態(tài)性分析 Fas啟動(dòng)區(qū)-670位點(diǎn)對(duì)照組以AA基因型最多，而肝癌組以AG基因型最多；肝癌組AA基因型頻率較對(duì)照組明顯減低，AG基因型頻率明顯增高，GG基因型頻率有增高趨勢，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝癌組Fas-670位點(diǎn)G等位基因頻率與對(duì)照組比較顯著增高，A等位基因頻率顯著降低；肝癌組Fas-670位點(diǎn)G等位基因攜帶者頻率較對(duì)照組顯著增高。

8、 第三部分：FasL、Fas反義寡核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的抑制作用 經(jīng)FasL ASODN作用48h后HepG2.2.15細(xì)胞FasL的表達(dá)率下降，F(xiàn)asL ASODN濃度為120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L的處理組FasL的表達(dá)率分別為13.07％、7.94％、5.54％，與對(duì)照組18.06％相比均有顯著差異；且FasL表達(dá)率隨ASODN濃度的增加而下降，呈劑量相關(guān)性。而相應(yīng)濃度Fas

9、L SODN處理組FasL表達(dá)率與對(duì)照組比較均無顯著差異。HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)FasL ASODN作用后FasL mRNA水平下降，電泳圖像示條帶變淺，以β-actin基因作內(nèi)參照，ASODN組FasLmRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.3433，而對(duì)照組及SODN組分別為0.8023、0.8512。HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)FasL ASODN作用后，與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)，Jurkat細(xì)胞凋亡率下降為11.04％，與對(duì)照組21.81％

10、比較有顯著差異；而SODN組Jurkat細(xì)胞凋亡率為21.55％，與對(duì)照組比較無顯著差異。但是，HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)FasL ASODN作用后，用CH11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率與對(duì)照組相比無明顯變化。 經(jīng)Fas ASODN作用后Jurkat細(xì)胞Fas的表達(dá)率下降，F(xiàn)as ASODN濃度為120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L的處理組Fas的表達(dá)率分別為63.28％、51.53％、46.94％，與對(duì)照組87.

11、23％相比均有顯著差異；且Fas表達(dá)率隨ASODN濃度的增加而下降，呈劑量相關(guān)性。而相應(yīng)濃度Fas SODN處理組Fas表達(dá)率與對(duì)照組比較均無顯著差異。Jurkat細(xì)胞經(jīng)Fas ASODN作用后Fas mRNA水平下降，電泳圖像示條帶變淺，以β-actin基因作內(nèi)參照，ASODN組Fas mRNA的相對(duì)表達(dá)系數(shù)為0.4229，而對(duì)照組及SODN組分別為0.8540、0.9616。Jurkat細(xì)胞經(jīng)FasASODN作用后，與HepG2.2

12、.15細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞凋亡率下降為14.28％，與對(duì)照組22.17％比較有顯著差異；而SODN組Jurkat細(xì)胞凋亡率為20.94％，與對(duì)照組比較無顯著差異。 第四部分：細(xì)胞因子IFN-α對(duì)肝癌細(xì)胞Fas表達(dá)及凋亡的影響 HepG2.2.15細(xì)胞與IFN-α作用24h后Fas表達(dá)率明顯增加，IFN-α濃度分別為2000U/ml、1000U/ml、500U/ml的A1、A2、A3三組Fas表達(dá)率分別為22.02％、l8.1

13、2％、15.04％，與對(duì)照組1.71％比較均有顯著差異；且Fas表達(dá)率隨IFN-α濃度的降低而降低。加入CHll后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均明顯增加，A1、A2、A3三組分別為l7.26％、16.16％、12.02％，與對(duì)照組5.86％比較有顯著差異，且隨IFN-α濃度的降低而降低。 結(jié)論： 1．HepG2.2.15細(xì)胞Fas表達(dá)低下，能抵抗FasL誘導(dǎo)的凋亡。 2．HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)有功能的FasL，可

14、反向誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，從而抑制T細(xì)胞的免疫功能。 3．Fas/FasL途徑是肝癌細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一，可成為免疫治療的新靶點(diǎn)。 4．肝癌組織Fas基因啟動(dòng)區(qū)-670位點(diǎn)AA型減少、AG型增高、G等位基因頻率及G等位基因攜帶者頻率增高，提示該位點(diǎn)A→G替換可能是肝癌Fas表達(dá)低下的原因之一，還可能是肝癌的易感因素。 5．HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)FasL A SODN后，F(xiàn)asL-mRNA降低；細(xì)胞

15、表面FasL表達(dá)下降；與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)，Jurkat細(xì)胞的凋亡率下降。提示FasL ASODN轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效地封閉肝癌細(xì)胞FasL表達(dá)而使其誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的能力減弱，從而逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的免疫抑制作用。 6．Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas ASODN后，F(xiàn)as-mRNA降低；細(xì)胞表面Fas表達(dá)下降；與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)后Jurkat細(xì)胞的凋亡率下降。提示Fas ASODN轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過有效地封閉T細(xì)胞Fas表達(dá)而阻斷肝癌細(xì)胞

16、誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡，保護(hù)免疫細(xì)胞功能，逆轉(zhuǎn)免疫抑制。 7．FasL ASODN不能直接增加肝癌細(xì)胞的凋亡，而是通過阻斷腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的破壞，間接促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。 8．經(jīng)IFN-α作用后HepG2.2.15細(xì)胞Fas表達(dá)增加；由CH11誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加。提示IFN-α可通過上調(diào)細(xì)胞Fas表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)Fas介導(dǎo)凋亡的抵抗。 9．Fas、FasL ASODN及IFN-α逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞免疫